Κατεύθυνση Αναλυτική Χημεία
Βιβλιοθήκη Σχολής Θετικών Επιστημών

2015-11-02

2015

Πουμπουρίδου Νικολέτα

Λιανίδου Ευρύκλεια Καθηγήτρια (Επιβλέπουσα), Κρούπης Χρήστος Επίκ. Καθηγητής, Κουππάρης Μιχαήλ Καθηγητής

Μελέτη και κλινική αξιολόγηση νέων μοριακών δεικτών καρκίνου του μαστού

Ελληνικά

Study and clinical evaluation of new markers in breast cancer

Πρόσφατες μελέτες συμπεριλαμβάνουν το γονίδιο PALB2 (Partner and localizer of
BRCA2) στην συνεχώς αυξανόμενη λίστα των γονιδίων κληρονομούμενου καρκίνου του
μαστού. Εντοπίζεται στη χρωμοσωμική περιοχή 16p12.1 και αποτελείται από 13
εξόνια που μεταγράφουν mRNA περίπου 3,5 Kb που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 1186
αμινοξέων. Τα εξόνια 4 και 5 είναι αισθητά μεγαλύτερα από όλα τα άλλα (65 % του
γονιδίου). Οι παθογνωμικές μεταλλάξεις του προσδίδουν έναν σοβαρό κίνδυνο
καρκίνου του μαστού στους ετεροζυγώτες και αναιμία Fanconi στους φορείς
διαλληλικών μεταλλάξεων (γι’ αυτό αλλιώς ονομάζεται και FANCN). Οι μεταλλάξεις
του είναι σπάνιες και έχουν ανιχνευθεί στο 1-2 % των BRCA αρνητικών γυναικών με
καρκίνο του μαστού. Η πρωτεΐνη PALB2 αποτελεί τον συνδετικό κρίκο των BRCA2 και
BRCA1 που εντοπίζονται στον πυρήνα και συμμετέχει στην επιδιόρθωση των
σπασιμάτων της διπλής έλικας του DNA μέσω του αλάθητου ομόλογου ανασυνδυασμού.
Η σημαντική του συνεισφορά θα μπορούσε να περιοριστεί αρκετά, εκτός από την
ύπαρξη μεταλλάξεων, εάν επηρεαζόταν από επιγενετικούς μηχανισμούς όπως την
μεθυλίωση των CpG νησίδων του υποκινητή. Σ’ αυτή την περίπτωση, οι ασθενείς θα
μπορούσαν να ωφεληθούν από θεραπευτική αγωγή με PARP αναστολείς.
Σκοπός της εργασίας ήταν: Α) η πλήρη γενετική μελέτη του γονιδίου PALB2 για την
εύρεση τυχόν μεταλλάξεων σε δείγματα DNA περιφερικού αίματος ασθενών με
κληρονομούμενο καρκίνο του μαστού και των ωοθηκών Β) η ανάλυση έκφρασης του
γονιδίου PALB2 σε δείγματα ιστού ασθενών με σποραδικό καρκίνο του μαστού για
τον εντοπισμό τυχόν επιγενετικών μηχανισμών που να εμποδίζουν την έκφρασή του.
Μέθοδοι
Για τη γενετική ανάλυση των μεγάλων εξονίων του γονιδίου (εξόνιο 4 και 5)
αναπτύχθηκε νέα μεθοδολογία PTT (Protein Truncation Test) ενώ για τα υπόλοιπα
μικρά εξόνια του γονιδίου εφαρμόστηκε μεθοδολογία HRMA. Τα αποτελέσματα
επιβεβαιώθηκαν σ’όλα τα δείγματα με την μεθοδολογία DNA Sequencing που είχε
αναπτυχθεί από την ομαδα μας. Επιπλέον, το γονίδιο ελέγχθηκε και για μεγάλες
γενωμικές αναδιατάξεις με την μέθοδο MLPA.
Για την ανάλυση έκφρασης του γονιδίου PALB2, αναπτύχθηκαν και επικυρώθησαν
μεθοδολογίες pyrosequencing για την μελέτη μεθυλίωσης του υποκινητή του
γονιδίου και RT-qPCR με ανιχνευτή TaqMan στο Light Cycler για την
ποσοτικοποίηση των PALB2 mRNA μεταγράφων. Απομονώθηκε RNA από 91 καρκινικά
δείγματα (και 4 φυσιολογικά) και παράχθηκε cDNA. Στην συνέχεια έγινε προσπάθεια
επιβεβαίωσης των αποτελεσμάτων έκφρασης με PALB2 πολυκλωνικό αντίσωμα με την
μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας (IHC).
Αποτελέσματα – Συμπεράσματα γενετικής ανάλυσης PALB2 γονιδίου
Κατά τη γενετική ανάλυση 57 δειγμάτων (ανάμεσά τους 15 με μυελοειδή καρκίνο του
μαστού) βρέθηκε σε δύο δείγματα η παρανοηματική μετάλλαξη Q599R, σε πέντε η
συνώνυμη μετάλλαξη Τ1100Τ και σε ένα μια νέα ιντρονική μετάλλαξη. Όλες
θεωρούνται πολυμορφισμοί και δεν ανιχνεύθηκε παθογνωμική μετάλλαξη. Η MLPA
ανάλυση απέβηκε αρνητική σ’όλα τα δείγματα. Η μελέτη αυτή είναι η πρώτη
καταγεγραμμένη PALB2 γενετική ανάλυση στον σπάνιο υπότυπο των μυελοειδών
καρκινωμάτων μαστού.
Αποτελέσματα – συμπεράσματα έκφρασης PALB2 γονιδίου
Κατά τη μελέτη μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου δε βρέθηκε κανένα δείγμα
που να είναι μεθυλιωμένο, συνεπώς η μεθυλίωση του DNA δεν φαίνεται να είναι
ένας πιθανός μηχανισμός αποσιώπησης του γονιδίου. Κατά την ανάλυση έκφρασης με
RT- qPCR, 4 δείγματα από τα 91 δεν εμφάνισαν έκφραση. Το γεγονός αυτό
διερευνήθηκε περαιτέρω με πειράματα ανοσοϊστοχημείας. Κατέδειξαν μόνο
κυτταροπλασματική χρώση της PALB2 πρωτεΐνης και καθόλου πυρηνική όπως
αναμενόταν γεγονός που πιθανόν οφείλεται σε ελαττωματικό αντίσωμα και συνεπώς
δεν μπορούσε να εξαχθεί συμπέρασμα για τον λόγο μη έκφρασης του γονιδίου. O
μέσος όρος των αντιγράφων ήταν 7,23104 copies/μg ολικού RNA, ενώ η μέση τιμή
ήταν 1,34104 copies/μg (εύρος 3,5110 to 1,23106 copies/μg). Έγινε προσπάθεια
συσχέτισης των επιπέδων PALB2 mRNA με τα κλινικά και ιστοπαθολογικά
χαρακτηριστικά των όγκων που αναλύθηκαν (μέγεθος όγκου, βαθμός, λεμφαδένες,
μετάσταση, ορμονικούς υποδοχείς, C-ERBB2 έκφραση) ωστόσο δεν βρέθηκε κάποιος
στατιστικά σημαντικός συσχετισμός. Δεν φαίνεται λοιπόν να αποτελεί η PALB2
έκφραση καλό προγνωστικό και προβλεπτικό δείκτη.

PALB2, Πρόωρος τερματισμός πρωτεϊνοσύνθεσης, Αντίστροφη μεταγραφάση, Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, Μεθυλίωση DNA

Όχι

0

Ναι

182

241

Δεν επιτρέπεται η πρόσβαση στο αρχείο.

https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/object/1309035