Περίληψη:
Η παρούσα εργασία παρουσιάζει τα αποτελέσματα της ex vivo πειραματικής μελέτης της επίδρασης των παραγώγων του καπνού στα έμμορφα στοιχεία του αίματος, εστιάζοντας στα ερυθροκύτταρα και αιμοπετάλια. Το νέο χαρακτηριστικό της μελέτης είναι το γεγονός ότι πραγματοποιείται με τη βοήθεια Μικροσκοπίου Ατομικής Δύναμης-ΜΑΔ (Atomic Force Microscope-AFM), το οποίο δίνει τη δυνατότητα «χαρτογράφησης» της μεμβράνης κυττάρων στη νανοσκοπική κλίμακα (1nm=10-9m). Δεδομένου του εισαγωγικού χαρακτήρα της παρούσας εργασίας, προτιμήσαμε να μελετήσουμε μόνο μία δότρια (Δ.Τ.), αλλά διεξοδικά. Μετά τη λήψη του δείγματος με φλεβοκέντηση, ακολούθησε άμεσα (εντός 2 ωρών) η επεξεργασία του στις κατηγορίες που αναφέρονται πιο κάτω.
Σε πειραματικό επίπεδο, αρχικά, παρασκευάζονται οι εξής κατηγορίες δειγμάτων: 1) δείγμα αναφοράς αιθανόλης (70% σε Η2Ο), 2) δείγμα αναφοράς παραγώγων καπνού σε αιθανόλη (70% σε Η2Ο), 3) δείγμα αναφοράς αυτόλογου πλάσματος, 4) δείγμα αναφοράς αυτόλογου πλάσματος σε αιθανόλη (70% σε Η2Ο), 5) δείγματα αναφοράς αυτόλογου πλάσματος με παράγωγα καπνού σε αιθανόλη (70% σε Η2Ο), 6) δείγμα αίματος σε αυτόλογο πλάσμα, 7) δείγματα αίματος σε αιθανόλη (70% σε Η2Ο), 8) δείγματα αίματος με παράγωγα καπνού διαλυμένα σε αιθανόλη (70% σε Η2Ο). Σημειώνεται ότι χρησιμοποιήσαμε ως διαλύτη για τα παράγωγα καπνού αιθανόλη, λόγω της καλής τους διαλυτότητας σε αυτήν. Τα δείγματα αίματος αφορούν δύο διακριτές κυτταρικές σειρές: α) ερυθροκύτταρα και β) αιμοπετάλια. Λεπτομέρειες για τις ακριβείς αναλογίες/συγκεντρώσεις δίνονται στον Πίνακα του Παραρτήματος στο τέλος της εργασίας.
Χρησιμοποιήθηκαν οι εξής πειραματικές τεχνικές: α) φυγοκέντριση για την απομόνωση των ερυθροκυττάρων, αιμοπεταλίων και αυτόλογου πλάσματος, β) ex vivo ωρίμανση του εκάστοτε δείγματος με ήπια ανάδευση (20-30 στροφές το λεπτό) σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, γ) κυτταρικός φυγοκεντρητής για τη δημιουργία μονοστρωματικών υμενίων ερυθροκυττάρων και αιμοπεταλίων, δ) Οπτικό Μικροσκόπιο (ΟΜ) για την εισαγωγική αξιολόγηση των μορφολογικών και γεωμετρικών χαρακτηριστικών των δειγμάτων στην κλίμακα των μικρομέτρων (1μm=10-6m) και την εξακρίβωση της καταλληλότητάς τους για την περεταίρω μελέτη με το ΜΑΔ, στο οποίο θα αναφερθούμε αμέσως πιο κάτω. Ακόμα, χρησιμοποιήθηκε ε) φασματοφωτομετρία UV-visible για να διαπιστώσουμε την παρουσία αιθανόλης και παραγώγων καπνού σε αιθανόλη και να επιβεβαιώσουμε τη σχετική τους συγκέντρωση στα διάφορα δείγματα που μελετήσαμε.
Η πειραματική τεχνική ΜΑΔ είναι η βασική που χρησιμοποιήθηκε στην πτυχιακή μας εργασία δεδομένου ότι επιτρέπει την απεικόνιση των κυτταρικών μεμβρανών σε νανοσκοπική κλίμακα: μία αιχμηρή ακίδα πυριτίου διαμέτρου <10nm υποβάλλεται σε εξαναγκασμένη ταλάντωση και ιχνηλατεί προοδευτικά την επιλεγμένη περιοχή με κατάλληλο βήμα (5-500nm), καταγράφοντας το σήμα της μορφολογίας σε ψηφιακή μορφή. Έτσι, με την τεχνική ΜΑΔ καταγράφεται ψηφιακή πληροφορία, μέσα από την οποία μπορούμε να μελετήσουμε όχι μόνο τα μικροσκοπικά αλλά κυρίως τα νανοσκοπικά χαρακτηριστικά των κυττάρων.
Στην παρούσα πτυχιακή εργασία εστιάζουμε κυρίως στη χρήση του ΜΑΔ και μελετάμε: α) στα ερυθροκύτταρα το ποσοστό αi) των εξελκώσεων (επιφανειακές αποδομήσεις των κυττάρων, που περιορίζονται κατά κανόνα στη μεμβράνη τους, με διάμετρο>0,5μm και βάθος<20nm) και αii) των κυστιδίων (μικρο/νανο-σκοπικά σωματίδια που προέρχονται από αποβολή κυτταροπλάσματος πιθανά συνοδευόμενου και από κυτταρική μεμβράνη, με διάμετρο>0,5μm), β) στα αιμοπετάλια το ποσοστό των ψευδοποδίων (νηματοειδείς σχηματισμοί, με μήκος>2μm). Ο πληθυσμός, Ν, των ερυθροκυττάρων ή αιμοπεταλίων που μελετάμε είναι κατά μέσο όρο 30. Στα πιο κάτω δεδομένα το σφάλμα ορίζεται ως ένα συμβάν προς το συνολικό πληθυσμό των κυττάρων, 1 συμβάν/Ν.
Από τη μελέτη των δειγμάτων των ερυθροκυττάρων, καταλήξαμε στο εν πρώτοις απροσδόκητο συμπέρασμα ότι η εμπλουτισμένη με παράγωγα καπνού αιθανόλη φαίνεται να δρα προστατευτικά στα κύτταρα συγκρινόμενη με την αιθανόλη (70% σε H2O), αυτή καθ’ αυτή. Συγκεκριμένα, παρατηρήσαμε ότι σε δείγμα αναφοράς άθικτου αίματος (χωρίς καμία επεξεργασία ή προσθήκη αντιδραστηρίου) έχουμε 0,44±0,02 εξελκώσεις και 0,05±0,02 κυστίδια/ερυθροκύτταρο, στο δείγμα του αίματος με την αιθανόλη έχουμε 1,18±0,03 εξελκώσεις και 0,59±0,03 κυστίδια/ερυθροκύτταρο, ενώ στο δείγμα του αίματος με την εμπλουτισμένη με παράγωγα καπνού αιθανόλη έχουμε 0,86±0,03 εξελκώσεις και 0,62±0,03 κυστίδια/ερυθροκύτταρο. Δηλαδή, είναι προφανής η επιβλαβής δράση της αιθανόλης και η σχετικά προστατευτική δράση των παραγώγων καπνού που βρίσκονται διαλυμένα σε αιθανόλη, σε σχέση με την αιθανόλη, αυτή καθ’ αυτή.
Αντίθετα, στα δείγματα των αιμοπεταλίων, φαίνεται ότι τα παράγωγα καπνού διαλυμένα στην αιθανόλη εντείνουν ακόμα περισσότερο τη διαδικασία της ενεργοποίησής τους σε σχέση με την αιθανόλη αυτή καθ’ αυτή. Αυτό προκύπτει από το γεγονός ότι το δείγμα αναφοράς των αιμοπεταλίων (χωρίς αντιδραστήριο αιθανόλης ή παραγώγων καπνού σε αιθανόλη) εμφάνιζε ελαφριά ενεργοποίησή τους (μικρή αύξηση του μεγέθους, χωρίς δημιουργία ψευδοποδίων), λόγω της μηχανικής καταπόνησης που υπέστησαν κατά τη φυγοκέντριση. Αυτή η εικόνα άλλαξε με την προσθήκη αιθανόλης, όπου πλέον τα αιμοπετάλια είναι ενεργοποιημένα, δημιουργούν συσσωματώματα και παρουσιάζουν ψευδοπόδια, με στατιστική 0,27±0,02 ψευδοπόδια/αιμοπετάλιο. Η εικόνα αυτή εντάθηκε περεταίρω στο δείγμα των αιμοπεταλίων όταν προσθέσαμε παράγωγα καπνού διαλυμένα σε αιθανόλη, αφού τα συσσωματώματα ήταν μεγαλύτερα και η ενεργοποίηση των κυττάρων αυξημένη με 0,57±0,03 ψευδοπόδια/αιμοπετάλιο. Για διπλάσια συγκέντρωση παραγώγων καπνού διαλυμένων σε αιθανόλη, προέκυψε στατιστική με 0,58±0,02 ψευδοπόδια/αιμοπετάλιο, δηλαδή φαίνεται να μην υπάρχουν ιδιαίτερες μεταβολές πέρα από μία κρίσιμη συγκέντρωση παραγώγων καπνού διαλυμένων σε αιθανόλη.
