Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Ε. Λιανίδου, Καθηγήτρια Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ
Α. Σκορίλας, Καθηγητής Κλινικής Βιοχημείας, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Jan Traeger- Synodinos, Αναπλ. Καθηγήτρια Γενετικής, Εργαστήριο Ιατρικής
Γενετικής, Χωρέμειο Ερευνητικό Εργαστήριο, Τμήμα Ιατρικής, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Η ολοκλήρωση της ανάλυσης του ανθρώπινου γονιδιώματος, το 2001, έθεσε τη βάση για την αναζήτηση διαφορετικών τεχνικών για την αλληλούχηση, όχι πλέον σε επίπεδο γονιδίου ή συγκεκριμένων περιοχών αλλά σε επίπεδο γονιδιώματος. Από το 2005 μέχρι σήμερα, έχουν αναπτυχθεί διαφορετικές τεχνολογίες έτσι ώστε να μιλάμε πλέον για μαζική παράλληλη αλληλούχηση (massive parallel sequencing) πολλών περιοχών του γονιδιώματος ή και ακόμα ολόκληρου του γονιδιώματος. Αν και η τεχνολογία του κάθε συστήματος είναι διαφορετική, έχουν παρόμοια στάδια κατά τη διαδικασία τους, όπως την κοπή του DNA σε τυχαία τμήματα, την προσθήκη ειδικών αλληλουχιών-ανταπτόρων (προσαρμογέων) στα άκρα των τμημάτων του DNA, την μεταφορά των τμημάτων σε σφαιρίδια ή σε πλακίδιο, την ενίσχυση των τμημάτων με σκοπό την κατασκευή DNA βιβλιοθήκης, δηλαδή βιβλιοθήκης που περιλαμβάνει τα θραύσματα DNA που τελικώς θα αλληλουχηθούν.
Η ροή εργασίας για την εφαρμογή αλληλούχησης επόμενης γενιάς στην κλινική πράξη περιλαμβάνει τρεις κύριες φάσεις, την προ-αναλυτική φάση, την αναλυτική φάση και την μετά-αναλυτική φάση. Η προ-αναλυτική φάση περιλαμβάνει τη συλλογή πληροφοριών σχετικά με το οικογενειακό ιστορικό του ασθενούς και τη συστηματική αξιολόγηση του φαινοτύπου, το είδος της δοκιμασίας που θα εφαρμοστεί, τη λήψη δείγματος, την ενημέρωση του ασθενούς και τέλος τη συγκατάθεση του. Η αναλυτική φάση περιλαμβάνει έναν αριθμό εργαστηριακών βημάτων συμπεριλαμβανομένου την προετοιμασία του δείγματος, την κατασκευή «βιβλιοθήκης», τον εμπλουτισμό του στόχου και την αντίδραση αλληλούχησης. Επίσης, περιλαμβάνει τρία επίπεδα ανάλυσης δεδομένων, την πρωτοβάθμια (primary), τη δευτεροβάθμια (secondary) και την τριτοβάθμια ανάλυση και την κατηγοριοποίηση των παραλλαγών που εξάχθηκαν. Η μετα-αναλυτική φάση ξεκινάει με την αξιολόγηση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων της αναλυτικής φάσης και τελειώνει με τη σύνταξη της αναφοράς και παράδοσής της στον ασθενή με γενετική συμβουλευτική.
Η αλληλούχηση επόμενης γενιάς μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε διάφορα επίπεδα πολυπλοκότητας. Αυτά περιλαμβάνουν αλληλούχηση επιλεγμένων γονιδίων (πάνελ) που σχετίζονται με κάποια ασθένεια (Disease-targeted gene panel), αλληλούχηση των εξονίων όλων των γονιδίων του γονιδιώματος (Whole Exome Sequencing-WES) και αλληλούχηση όλου του γονιδιώματος (Whole Genome Sequencing-WGS). Συγκρίνοντας τα τρία επίπεδα, είναι ξεκάθαρο ότι το WGS είναι ανώτερο από τα άλλα δύο παράγοντας πιο πλήρη δεδομένα για το γονιδίωμα που εξετάζεται. Το WES είναι σημαντικά πιο οικονομικό από το WGS και αποτελεί μια αποτελεσματική στρατηγική για την ανίχνευση μεταλλαγών που ευθύνονται για ασθένειες. Η ανάλυση πάνελ γονιδίων, αντιπροσωπεύει μια εναλλακτική τακτική, η οποία έχει σημαντικά χαμηλότερο κόστος αλληλούχησης, αλλά θα επιτύχει μόνο εάν το γονίδιο που προκαλεί την ασθένεια περιλαμβάνεται στο πάνελ.
Οι τεχνολογίες αλληλούχησης επόμενης γενιάς έχουν αλλάξει δραματικά το πεδίο της μοριακής διαγνωστικής. Η αλληλούχηση των εξονίων του γονιδιώματος (WES) έχει εξελίξει τη βιοϊατρική έρευνα επεκτείνοντας τα αποτελέσματα και τις εφαρμογές στην κλινική διάγνωση. Μέσω του WES μπορεί κανείς να αποκαλύψει νέες παραλλαγές που δεν είναι γνωστό ότι σχετίζονται με κάποια νόσο ή προκαλούν εξαιρετικά σπάνιες ασθένειες και να ταυτοποίησει παθογόνες παραλλαγές για ασθένειες οι οποίες δεν έχουν σχέση με το κύριο σκοπό της εξέτασης που ζητήθηκε (δευτερεύοντα ευρήματα). Επίσης, μπορεί να προσδιοριστεί η ύπαρξη φορείας για υπολειπόμενη ασθένεια, αλλά και φαρμακογενετικές παραλλαγές που μπορεί να επηρεάσουν την ανταπόκριση ενός ατόμου σε κάποιο φαρμακευτικό παράγοντα. Ωστόσο είναι σημαντικό τα υποβληθέντα άτομα σε τέτοια εξέταση να ενημερωθούν σχετικά με τα αναμενόμενα αποτελέσματα, την πιθανότητα και το είδος των τυχαίων ευρυμάτων, ποια αποτελέσματα μπορούν να ανακοινωθούν και ποια όχι, καθώς ζητήματα διαγνωστικής απόδοσης και βιοηθικής παραμένουν για την χρήση του WES στην κλινική πράξη.
Για τη χρήση Αλληλούχησης Νέας Γενιάς στην κλινική πράξη είναι αναγκαία η βελτιστοποίηση των εργαστηριακών πρωτοκόλλων, η κατάλληλη κατάρτιση του προσωπικού και η ανάπτυξη βιοπληροφορικών εργαλείων για τη διαχείρηση και ερμηνεία των πολύπλοκων δεδομένων που παράγονται. Επίσης, απαιτείται εντατική αλληλεπίδραση μεταξύ εργαστηριακών ειδικών, κλινικών γενετιστών, βιοπληροφορικών και άλλων ιατρικών ειδικοτήτων.
Στη συγκεκριμένη μελέτη εφαρμόστηκε πιλοτική δοκιμή της Αλληλούχησης Νέας Γενιάς στην κλινική πράξη προσδιορίζοντας τις απαιτήσεις, τις ανάγκες και τους περιορισμούς της τεχνολογίας αυτής μέσα από τη σύγκριση τριών ροών εργασίας (‘Workflows’). Παρόλο λοιπόν που δεν υπάρχει αμφιβολία ότι οι τεχνολογίες προσδιορισμού της αλληλουχίας έχουν τη δυνατότητα να ωφελήσουν την υγεία, απαιτούνται σαφείς κατευθυντήριες οδηγίες για τις μεθοδολογίες NGS σε όλα τα στάδια.
Λέξεις-κλειδιά:
Αλληλούχηση Νέας Γενιάς, Κλινική πράξη, Αλληλούχηση, Εξόνια, Γονιδίωμα
