Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Αναπλ. Καθηγητής Γ. Διαλλινάς (επιβλέπων), Καθηγητής Ε. Μικρός, Καθηγητής Ε. Φριλίγγος
Πρωτότυπος Τίτλος:
Γενετικές, μοριακές, βιοχημικές και βιοφυσικές προσεγγίσεις στη μελέτη των σχέσεων δομής-λειτουργίας διαμεμβρανικών μεταφορέων πουρινών
Μεταφρασμένος τίτλος:
Genetic, molecular, biochemical and biophysical approaches in studying structure-function relationships of transmembrane purine transporters
Περίληψη:
Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες μεταφοράς διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη,
διαφοροποίηση και επιβίωση των ευκαρυωτικών κυττάρων. Πολλές ανθρώπινες
ασθένειες έχουν συνδεθεί με δυσλειτουργία ή τροποποιημένη λειτουργία
μεμβρανικών μεταφορέων, όπως η κυστική ίνωση και η αδρενολευκοδυστροφία.
Εξαιτίας τεχνικών δυσκολιών, δεν είναι δυνατή η κρυστάλλωση και απόδοση της
τρισδιάστατης δομής όλων των πρωτεϊνών. Για το λόγο αυτό, μια πρώτη ιδέα για
την αναδίπλωση των διαφόρων περιοχών της πρωτεΐνης θα μπορούσε να ληφθεί μέσω
μοντέλων ομολογίας, εάν υπάρχει διαθέσιμη μια αντιπροσωπευτική κρυσταλλογραφική
δομή. Τα τελευταία χρόνια έχει κρυσταλλωθεί ένας μεγάλος αριθμός πρωτεϊνών
μεταφοράς, και μέσω αυτών έχουν δημιουργηθεί μοντέλα ομολογίας συγγενικών
πρωτεϊνών. Τέτοιο παράδειγμα αποτελούν οι μεταφορείς δευτερογενούς ενεργότητας.
Καθώς η κρυσταλλογραφία αποδίδει ένα στατικό, μόνο, στιγμιότυπο δυναμικών
πρωτεϊνικών δομών έξω από τη λιπιδική διπλοστοιβάδα, η οποία αποτελεί τη φυσική
τους τοπολογία, απαιτούνται ταυτόχρονα και άλλες βιολογικές προσεγγίσεις.
Προκειμένου να αποσαφηνιστούν οι παράγοντες που καθορίζουν την εκλεκτικότητα
του υποστρώματος σε δομές με χαμηλή πρωτοταγή ομολογία, αλλά υψηλή δομική
ομοιότητα είναι επιτακτική η συνδυαστική χρήση δεδομένων κρυσταλλογραφίας καθώς
και συστηματικής μεταλλαξιγένεσης. Η τελευταία αυτή βιολογική προσέγγιση σε
συνδυασμό με την κατασκευή μοντέλου ομολογίας μπορεί να αποτελέσει μια
αποτελεσματική και αξιόπιστη προσέγγιση στη μελέτη των σχέσεων δομής-
λειτουργίας των μεταφορέων δευτερογενούς ενεργότητας. Στα πλαίσια της παρούσας
διδακτορικής διατριβής μελετήθηκαν με βιοφυσικές και γενετικές/μοριακές
προσεγγίσεις δύο μεταφορείς πουρινών στον πρότυπο ασκομύκητα Aspergillus
nidulans, ο UapA και ο FcyB. O UapA είναι ένας συμμεταφορέας ουρικού οξέος-
ξανθίνης/Η+ της οικογένειας NAT/NCS2, για τον οποίο υπάρχει πληθώρα δομικών και
λειτουργικών μεταλλαγών. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής
κατασκευάστηκε το μοντέλο ομολογίας του, στηριζόμενο στην δομή του UraA, την
πρώτη κρυσταλλογραφία της οικογένειας. Το μοντέλο επαληθεύτηκε με μοριακή
δυναμική (Desmond). Με υπολογισμούς άκαμπτης και εύκαμπτης πρόσδεσης υπεδείχθη
η θέση δέσμευσης του υποστρώματος στον μεταφορέα, τα αμινοξικά κατάλοιπα που
συμμετέχουν, ο μηχανισμός πρόσδεσης και η πορεία του υποστρώματος από τη θέση
δέσμευσης προς το κυτταρόπλασμα (LMCS, Glide-IFD, QSAR). Προς επαλήθευση των
υπολογισμών κατασκευάστηκαν, με κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση, μεταλλαγές των
καταλοίπων που υποδείχθηκαν από τους υπολογισμούς ότι συμμετέχουν στη δέσμευση
και μεταφορά του υποστρώματος. Τα στελέχη που έφεραν τις μεταλλαγές αυτές
χαρακτηρίστηκαν πλήρως φαινοτυπικά (με δοκιμασίες ανάπτυξης σε πουρίνες ως
μοναδικές πηγές αζώτου) και βιοχημικά (με μετρήσεις πρόσληψης ραδιοσημασμένης
ξανθίνης και πειράματα ανταγωνισμού), καθώς επίσης μελετήθηκε και η
υποκυτταρική τους τοπολογία (με μικροσκοπική παρατήρηση της πρωτεΐνης
συνεζευγμένης με GFP). Η βιολογική αυτή προσέγγιση επαλήθευσε τους υπολογισμούς
πρόσδεσης και το προβλεπόμενο μοντέλο. Τέλος, κατασκευάστηκαν άλλα δύο μοντέλα
ομολογίας της οικογένειας, του μεταφορέα ξανθίνης SNBT1 (στον Rattus
novergicus) και του μεταφορέα L-ασκορβικού (στον Homo sapiens). Στα μοντέλα
αυτά με υπολογισμούς πρόσδεσης υπεδείχθη το κέντρο δέσμευσης του υποστρώματος
και συνεκρίθησαν τα κατάλοιπα που συμμετέχουν με τα αντίστοιχα του UapA.
Βρέθηκε ότι τα κατάλοιπα που συμμετέχουν είναι κοινά, υποδεικνύοντας την
εξελικτική τους σχέση. Ο FcyB είναι ένας συμμεταφορέας πουρινών/Η+ της
οικογένειας NCS1/PRT, χαρακτηρισμένος στον A. nidulans. Στα πλαίσια της
παρούσας διδακτορικής διατριβής κατασκευάστηκε το μοντέλο ομολογίας του ,
βασιζόμενο στη δομή του Mhp1 της ίδιας οικογένειας. Το μοντέλο αυτό
επιβεβαιώθηκε με υπολογισμούς μοριακής δυναμικής (Desmond). Τέλος, με
υπολογισμούς πρόσδεσης υπεδείχθη η θέση δέσμευσης των υποστρωμάτων (αδενίνη,
υποξανθίνη, γουανίνη, κυτοσίνη) στον μεταφορέα και τα εμπλεκόμενα αμινοξικά
κατάλοιπα. Βάσει αυτών των αποτελεσμάτων και της συντήρησης των καταλοίπων στην
στοίχιση πρωτοταγούς αλληλουχίας προτάθηκαν μεταλλαγές για την επαλήθευση των
υπολογισμών πρόσδεσης τόσο στον FcyB, όσο και σε άλλα μέλη της οικογένειας στον
A. nidulans (FurA, FurD).
Λέξεις-κλειδιά:
Aspergillus nidulans, Μεταφορείς πουρινών, Σχέσεις δομής-λειτουργίας, Οικογένεια μεταφορέων NAT, Υπολογισμοί πρόσδεσης
