Περίληψη:
Η μελέτη των επιπτώσεων της ατμοσφαιρικής ρύπανσης στην υγεία συνιστά ένα
πολυδιάστατο και πολυπαραγοντικό πρόβλημα, που εξακολουθεί να αποτελεί
αντικείμενο ενός τεράστιου αριθμού τοξικολογικών και επιδημιολογικών ερευνών.
Σήμερα, η πλειοψηφία αυτών των μελετών επικεντρώνεται κυρίως στο σωματιδιακό
κλάσμα της ρύπανσης (particulate matter, PM), δηλαδή στα αιωρούμενα στερεά
σωματίδια με αεροδυναμική διάμετρο 10μm, τα οποία θεωρούνται τα πλέον
επικίνδυνα. Λόγω των διαστάσεών τους, τα σωματίδια αυτά διεισδύουν και
συσσωρεύονται στα βαθύτερα σημεία του αναπνευστικού συστήματος, ενώ ο υψηλός
λόγος «επιφάνεια/μάζα», επιτρέπει την προσρόφηση ποικίλων τοξικών ενώσεων στην
επιφάνειά τους. Μεταξύ αυτών, τα βαρέα μέταλλα, οι πολυκυκλικές οργανικές
ενώσεις, ανόργανα ιόντα και ποικίλα βιογενή συστατικά ενοχοποιούνται – κατά
κανόνα – για την τοξική δράση των ρύπων. Σε επίπεδο οργανισμού, οι επιπτώσεις
της ατμοσφαιρικής ρύπανσης, καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα παθοφυσιο-λογικών
καταστάσεων, από απλούς δερματικούς ερεθισμούς και αλλεργικές αντιδράσεις, έως
χρόνια αναπνευστικά προβλήματα, θανάτους από καρδιαγγειακά αίτια και αυξημένο
κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου. Εκτός, όμως, από τις φυσικοχημικές ιδιότητες των
σωματιδιακών ρύπων, καθοριστικό ρόλο σε αυτές τις επιπτώσεις διαδραματίζουν και
επιπλέον παράγοντες, που αφορούν κυρίως στις συνθήκες έκθεσης (διάρκεια και
συχνότητα επεισοδίων έκθεσης, συγκέντρωση ρύπων) και στην ατομική ευαισθησία
(ηλικία, παθολογικό υπόβαθρο).
Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η καταγραφή των πρώιμων
σηματοδοτικών αποκρίσεων ενός μοντέλου επιθηλιακών κυττάρων πνεύμονα (Α549),
παρουσία μικρο- και νανο-σωματιδιακών ρύπων, διαφορετικής προέλευσης και
πολυπλοκότητας, προκειμένου να εντοπιστούν πρώιμες αλλαγές στη φυσιολογία και
τη σηματοδότηση των κυττάρων, που ενδέχεται να συμβάλλουν μακροπρόθεσμα στην
ανάπτυξη παθολογικού φαινοτύπου. Η ιστοειδικότητα των παρατηρούμενων αποκρίσεων
διερευνήθηκε μέσω συγκριτικής καταγραφής της απόκρισης ανθρώπινων επιθηλιακών
κυττάρων δέρματος (Α431), ενώ παράλληλα, μελετήθηκε και ο ρόλος των αντίστοιχων
φυσιολογικών ινοβλαστών. Μεταξύ των σηματοδοτικών μορίων και των μεταγραφικών
παραγόντων, που μελετήθηκαν, ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στην κινάση Αkt και στον
μεταγραφικό παράγοντα ΗΙF-1α, οι οποίοι προωθούν την κυτταρική επιβίωση και
θεωρούνται, πλέον, τυπικοί καρκινικοί δείκτες, καθώς ανιχνεύονται σε υψηλά
επίπεδα κατά τα πρώτα στάδια της καρκινογένεσης. Επιπλέον, ο μεταγραφικός
παράγοντας NrF2 χρησιμοποιήθηκε ως ένας αξιόπιστος δείκτης οξειδωτικού στρες.
Οι κατηγορίες ρύπων, που μελετήθηκαν, ήταν οι εξής: α) ένα πολύπλοκο
μικροσωματιδιακό μίγμα (ΡΜ2,5-10), που συλλέχθηκε στους χώρους εργοστασίου, σε
βιομηχανική περιοχή της Αθήνας, β) ένα πρότυπο μίγμα νανοσωματιδίων από
εξατμίσεις μηχανών εσωτερικής καύσης (Diesel Exhaust Particles, DEP) και γ) ο
κοινός οργανικός ρύπος, βενζο[α]πυρένιο (Β[α]Ρ). Το Β[α]Ρ, αν και δεν έχει
σωματιδιακή φύση, επιλέχθηκε ως ένα από τα βασικά οργανικά συστατικά των δύο
προηγούμενων μιγμάτων, προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός δράσης
των οργανικών ρύπων.
Παρουσία των μικροσωματιδιακών ρύπων παρατηρήθηκε σημαντική μείωση της
κυτταρικής επιβίωσης, η οποία ήταν αντιστρόφως ανάλογη της διαμέτρου των
σωματιδίων. Η κυτταροτοξική δράση του ανόργανου κλάσματος ήταν εντονότερη, σε
σύγκριση με το οργανικό, και θα μπορούσε, εν μέρει, να αποδοθεί στις υψηλές
συγκεντρώσεις θειικών και αμμωνιακών ιόντων, που ανιχνεύθηκαν κατά τη χημική
ανάλυση. Σε κάθε περίπτωση, παρατηρήθηκε, παράλληλη δοσοεξαρτώμενη μείωση στην
φωσφορυλίωση της κινάσης Αkt και στα πρωτεϊνικά επίπεδα του μεταγραφικού
παράγοντα HIF-1α.
Τα νανοσωματίδια DEP επιλέχθηκαν ως βασικό συστατικό του οργανικού κλάσματος
της σωματιδιακής ρύπανσης. Χαμηλές, μη κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις των DEP
προκάλεσαν ήπιο οξειδωτικό στρες (επαγωγή NrF2), χωρίς να μειώνουν την
κυτταρική επιβίωση και οδήγησαν σε άμεση συσσώρευση του ΗΙF-1α. Επιπλέον, τα
επίπεδα του μεταγραφικού παράγοντα αυξήθηκαν αθροιστικά, ύστερα από δύο δίωρες
επωάσεις με τα νανοσωματίδια και δεν επανήλθαν, ακόμα και μετά την απομάκρυνση
των ρύπων, για 22 ώρες. Η παράλληλη επαγωγή της οξυγενάσης της αίμης, ΗΟ-1, σε
αυτές τις συνθήκες, υποδηλώνει την προηγηθείσα ενεργοποίηση του μεταγραφικού
παράγοντα NrF2. Οι αποκρίσεις των κυττάρων Α549 ήταν αντίστοιχες, στο σύστημα
συγκαλλιέργειας των επιθηλιακών κυττάρων με φυσιολογικούς ινοβλάστες πνεύμονα.
Ιδιαίτερο ενδιαφέρον, παρουσιάζει το γεγονός ότι η παρακρινική επικοινωνία των
δύο κυτταρικών τύπων ενεργοποίησε όλους τους – υπό μελέτη – δείκτες επιβίωσης
στους φυσιολογικούς ινοβλάστες, οι οποίοι δεν βρίσκονταν σε άμεση επαφή με τα
νανοσωματίδια. Με βάση τα αποτελέσματα των πειραμάτων μας, αλλά και
υποστηρικτικά βιβλιογραφικά δεδομένα, προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες, όπως η
IL-1β, συμβάλουν σημαντικά στις παρατηρούμενες αποκρίσεις.
Το Β[α]Ρ εκδήλωσε ήπια κυτταροτοξικότητα, μόνο σε υψηλές συγκεντρώσεις, στις
οποίες επιβεβαιώθηκε και η γενοτοξική του δράση, μέσω της ανίχνευσης σταθερών
προϊόντων προσθήκης (DNA adducts) και θραύσεων του γενετικού υλικού. Επιπλέον,
η αλληλεπίδραση με τα τεχνητά, βιοσυμβατά νανοσωματίδια PLGA ενισχύει τις
επιπτώσεις, ακόμα και λιγότερο κυτταροτοξικών συγκεντρώσεων του ρύπου, πιθανόν
μέσω αύξησης της βιοδιαθεσιμότητάς του. Ωστόσο, οι μη κυτταροτοξικές
συγκεντρώσεις Β[α]Ρ ευνοούν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Α549, πιθανόν λόγω
ήπιου οξειδωτικού στρες (επαγωγή NrF2), και προκαλούν συσσώρευση του ΗΙF-1α,
μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού PI3Κ/Akt. Η επαγωγή των δύο μεταγραφικών
παραγόντων συνοδεύεται από την μετατόπισή τους στον πυρήνα και τη μεταγραφική
τους ενεργοποίηση. Η απόκριση του ΗΙF-1α στο Β[α]Ρ επιβεβαιώθηκε και στην
επιθηλιακή κυτταρική σειρά καρκινώματος δέρματος, Α431, καθώς και σε
πρωτογενείς καλλιέργειες φυσιολογικών ινοβλαστών δέρματος και πνεύμονα. Ανάλογα
αποτελέσματα καταγράφηκαν και κατά την επίδραση του Β[α]Ρ, παρουσία επιπλέον
στρεσογόνων συνθηκών, που χαρακτηρίζουν ποικίλες παθοφυσιολογικές καταστάσεις,
όπως η υποξία. Τέλος, η ενσωμάτωση ενός ποσοστού του λιπόφιλου Β[α]Ρ στις
κυτταρικές μεμβράνες και η αλληλεπίδρασή του με διαύλους Ca2+, διαταράσσει την
ομοιόσταση των ιόντων, αυξάνοντας τα βασικά επίπεδα Ca2+ στο κυτταρόπλασμα,
μειώνοντας το περιεχόμενο του ΕΔ και ενισχύοντας το δυναμικό πρόσληψης ιόντων
από το εξωκυττάριο περιβάλλον. Το σημειακό γεγονός της εισροής Ca2+, μέσω των
διαμεμβρανικών διαύλων, ενισχύει άμεσα τη φωσφορυλίωση της Αkt, στο επίπεδο της
πλασματικής μεμβράνης, συμβάλλοντας, με τον τρόπο αυτό, στην πρώιμη συσσώρευση
του HIF-1α.
Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της διδακτορικής διατριβής συνοψίζονται ως εξής:
Ο καρκινικός δείκτης HIF-1α επάγεται άμεσα, παρουσία χαμηλών, μη κυτταροτοξικών
συγκεντρώσεων οργανικών ρύπων. Η απόκριση αυτή είναι συστηματική μεταξύ
διαφορετικών κυτταρικών τύπων και ιστών, συνοδεύεται από τη μεταγραφική του
ενεργοποίηση και μεσολαβείται – σε σημαντικό βαθμό – από το σηματοδοτικό
μονοπάτι επιβίωσης, PI3K/Akt.
Η σύντομη, αλλά επαναλαμβανόμενη, έκθεση στους ρύπους έχει τη δυναμική να
προκαλέσει μακροπρόθεσμες αλλαγές στο σηματοδοτικό δυναμικό των κυττάρων. Όταν
οι μεταβολές αυτές αφορούν μόρια, που προωθούν την κυτταρική επιβίωση, είναι
πιθανό να συνεισφέρουν στη σταδιακή εξαλλαγή του κυτταρικού φαινοτύπου.
Η αλληλεπίδραση μεταξύ επιθηλιακών κυττάρων και ινοβλαστών, μέσω παρακρινικών
παραγόντων, συμβάλει στη διαμόρφωση της τελικής απόκρισης των κυττάρων στους
ρύπους. Συνεπώς, σε in vivo συνθήκες, η παρακρινική επικοινωνία μπορεί να
προκαλέσει μεταβολές ακόμη και σε κύτταρα, τα οποία δεν έρχονται σε άμεση επαφή
με τα σωματίδια.
Η ομοιόσταση των ιόντων ασβεστίου τροποποιείται παρουσία μη κυτταροτοξικών
συγκεντρώσεων οργανικών ρύπων. Συγκεκριμένα, το Β[α]Ρ αυξάνει το δυναμικό
πρόσληψης ιόντων ασβεστίου μέσω της πλασματικής μεμβράνης και η εισροή των
ιόντων ρυθμίζει έμμεσα την επαγωγή του HIF-1α, μέσω ενίσχυσης της φωσφορυλίωσης
της Akt.
