Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Δ. Βασιλακοπούλου, Αναπλ. Καθηγήτρια Ε.Κ.Π.Α. (επιβλέπουσα), Ε. Φραγκούλης, Καθηγητής Ε.Κ.Π.Α., Α. Σκορίλας, Αναπλ. Καθηγητής Ε.Κ.Π.Α.
Περίληψη:
Η L-3,4 διυδροξυ-φαινυλ-αλανίνη αποκαρβοξυλάση (L-Dopa αποκαρβοξυλάση, L-Dopa
decarboxylase ή DDC, EC 4.1.1.26) είναι το ένζυμο το οποίο καταλύει την
αποκαρβοξυλίωση της L-Dopa σε ντοπαμίνη. Η ντοπαμίνη αποτελεί έναν από τους
σημαντικότερους διαμεσολαβητές της επικοινωνίας μεταξύ νευρικού και
ανοσοποιητικού συστήματος δεδομένου ότι αποτελεί ρυθμιστικό παράγοντα του
πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης διαφόρων υποτύπων λευκών αιμοσφαιρίων.
Τα λευκά αιμοσφαίρια αλληλεπιδρούν με την ντοπαμίνη όταν, μετά από ενεργοποίηση
τους, διαπερνούν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό, αλλά και στην περιφέρεια, καθώς
τα λευκά αιμοσφαίρια έχουν την ικανότητα ενδογενούς σύνθεσης, έκκρισης και
πρόσληψης των κατεχολαμινών. Η ντοπαμίνη ασκεί τη ρυθμιστική της δράση μέσω των
υποδοχέων ντοπαμίνης που εντοπίζονται στην πλασματική μεμβράνη των λευκών
αιμοσφαιρίων. Παρότι πολλαπλά πειραματικά δεδομένα υποδεικνύουν την επικοινωνία
μεταξύ νευρικού και ανοσοποιητικού συστήματος, το μονοπάτι βιοσύνθεσης
κατεχολαμινών στα λευκά αιμοσφαίρια, δεν έχει πλήρως διαλευκανθεί. Επιπρόσθετα,
τα δεδομένα που αφορούν τη ρυθμιστική δράση της ντοπαμίνης παρουσιάζονται
αντιφατικά. Η ανάγκη να διερευνηθεί περαιτέρω η δράση της ντοπαμίνης στις
λειτουργίες του ανοσοποιητικού συστήματος ενισχύεται από δεδομένα σύμφωνα με τα
οποία μερικές από τις πιο σημαντικές νευροεκφυλιστικές ασθένειες, όπως η νόσος
του Parkinson και η σχιζοφρένεια έχουν συσχετιστεί με δυσλειτουργίες του
ανοσοποιητικού συστήματος. Συνεπώς, η πλήρης αποσαφήνιση των βιοχημικών
μονοπατιών στα οποία εμπλέκεται η ντοπαμίνη στο ανοσοποιητικό σύστημα μπορεί να
βοηθήσει στην κατανόηση της παθογένεσης και στη θεραπεία πολλών
νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Βάσει των ανώτερων δεδομένων καθώς και πρόσφατων
μελετών στο εργαστήριο μας οι οποίες αποκάλυψαν για πρώτη φορά την έκφραση της
πλήρους μήκους DDC και του εναλλακτικού μεταγράφου από το οποίο απουσιάζει το
εξώνιο 3 σε ανθρώπινα περιφερικά λευκά αιμοσφαίρια, σκοπός της παρούσας
διατριβής ήταν η περαιτέρω διερεύνηση της έκφρασης, της υποκυτταρικής
κατανομής, της ενζυμικής ενεργότητας της DDC αλλά και της ρύθμισης της σε
κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος του ανθρώπου.
Τα αποτελέσματα της διατριβής συνοψίζονται στις παρακάτω τρείς ενότητες:
• Μελέτη έκφρασης, τοπολογίας και ενζυμικής ενεργότητας της DDC στα
ανθρώπινα περιφερικά λευκά αιμοσφαίρια
Με σκοπό τη μελέτη της υποκυτταρικής κατανομής της DDC στα ανθρώπινα περιφερικά
λευκά αιμοσφαίρια, δείγματα ομογενοποιήματος λευκών αιμοσφαιρίων επεξεργάστηκαν
με το μη ιονικό απορρυπαντικό Triton X-114. Το ένζυμο εντοπίστηκε τόσο στο
υδρόφιλο κλάσμα όσο και στο υδρόφοβο και ισχυρά υδρόφοβο ίζημα υποδηλώνοντας το
συσχετισμό του μορίου με το μεμβρανικό κλάσμα και την ύπαρξη πληθυσμών με
διαφορετικό βαθμό υδροφοβικότητας στα λευκά αιμοσφαίρια. Με πειράματα
ανοσοστύπωσης κατά Western ανιχνεύτηκε η εναλλακτική ισομορφή της DDC, alt-DDC.
Σε πειράματα μέτρησης ενεργότητας του ενζύμου σε ομογενοποίημα λευκών
αιμοσφαιρίων η DDC εμφανίζεται ενεργή ως προς την αποκαρβοξυλίωση της L-Dopa
(mU/mg = 3,67 ± 0,31). Αν και τα επίπεδα ενεργότητας της DDC στα λευκά
αιμοσφαίρια είναι χαμηλότερα σε σχέση με τα επίπεδα ενεργότητας της DDC νεφρού
ανθρώπου, τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η DDC των λευκών
αιμοσφαιρίων προέρχεται όχι μόνο μέσω πρόσληψης από το μεσοκυττάριο υγρό αλλά
και μέσω ενδογενούς σύνθεσης της στον κυτταρικό αυτό πληθυσμό.
• Μελέτη έκφρασης, τοπολογίας και ενζυμικής ενεργότητας της DDC στην
κυτταρική σειρά U937
Προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω η έκφραση, η τοπολογία και η ενζυμική
ενεργότητα της DDC στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, χρησιμοποιήθηκε η
κυτταρική σειρά U937. Πρόκειται για ανθρώπινα μονοκύτταρα προέλευσης μακροφάγων
τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως ως μοντέλο λειτουργίας μακροφάγων. Με
πειράματα ανοσοστύπωσης κατά Western, η DDC ανιχνεύεται για πρώτη φορά στην
κυτταρική σειρά U937. Διερεύνηση της φύσης των μεταγράφων που παράγονται στον
υπό μελέτη κυτταρικό τύπο με αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής-αλυσιδωτής
αντίδρασης πολυμεράσης και περαιτέρω πειράματα ανοσοστύπωσης κατά Western
υποδεικνύουν ότι στην κυτταρική σειρά U937 παράγονται η alt-DDC και το νευρικού
τύπου μετάγραφο από το οποίο απουσιάζει το εξώνιο 3. Το πλήρους μήκους
μετάγραφο, καθώς και μη νευρικού τύπου μετάγραφο δεν ανιχνεύονται. Η
υποκυτταρική κατανομή της DDC στην κυτταρική σειρά U937 διερευνήθηκε με τη
χρήση του αντιδραστηρίου Triton X-114. Η επεξεργασία των δειγμάτων με το μη
ιοντικό απορρυπαντικό είχε ως αποτέλεσμα την ανάκτηση της DDC στο υδρόφιλο,
υδρόφοβο, αλλά και στο ισχυρά υδρόφοβο κλάσμα, υποδεικνύοντας το συσχετισμό του
ενζύμου με τις μεμβράνες της κυτταρικής σειράς. Η DDC που συνδέεται με τις
μεμβράνες απελευθερώνεται στο υπερκείμενο με απλή επώαση. Η απελευθέρωση
φαίνεται να είναι pH εξαρτώμενη και οι βέλτιστες συνθήκες απελευθέρωσης
εμφανίζονται στο pH 6-6,5. Προσδιορισμός της ενεργότητας του ενζύμου σε ολικό
ομογενοποίημα, στο διαλυτό και στο μεμβρανικό κλάσμα των υπό μελέτη κυττάρων
υποδηλώνει ότι η DDC είναι ενζυμικά ενεργή ως προς την αποκαρβοξυλίωση της
L-Dopa σε ντοπαμίνη σε όλα τα υποκυτταρικά κλάσματα της κυτταρικής σειράς. Τα
επίπεδα ενζυμικής ενεργότητας του μορίου στο μεμβρανικό κλάσμα προσδιορίζονται
κατά 70% υψηλότερα σε σχέση τις τιμές ενεργότητας σε ολικό ομογενοποίημα και
στο διαλυτό κλάσμα της κυτταρικής σειράς U937. Η DDC που απελευθερώνεται από το
μεμβρανικό κλάσμα εμφανίζεται ενζυμικά ενεργή παρουσιάζοντας τη μέγιστη τιμή
ενεργότητας όταν η απελευθέρωση πραγματοποιείται σε pH 6-6,5. Επώαση σταθερής
ποσότητας πρωτεϊνών μεμβρανικού κλάσματος παρουσία αυξανόμενων ποσοτήτων ολικής
πρωτεΐνης διαλυτού κλάσματος είχε ως αποτέλεσμα την μείωση της ενζυμικής
ενεργότητας της DDC παρέχοντας ενδείξεις για την πιθανή ύπ
αρξη κάποιου ρυθμιστικού μορίου της ενζυμικής ενεργότητας της DDC στο διαλυτό
κλάσμα της κυτταρικής σειράς U937. Η εξωγενής χορήγηση του χημικού αναστολέα
της DDC, carbidopa, σε καλλιέργεια κυττάρων U937 για 24 ώρες οδηγεί σε
φαινόμενα κυτταροτοξικότητας κατά ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο υποδεικνύοντας ότι
η DDC μπορεί να εμπλέκεται σε μηχανισμούς επιβίωσης και κυτταρικού θανάτου των
κυττάρων του ανοσοβιολογικού συστήματος. Ομοίως, επώαση των κυττάρων U937
παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων ντοπαμίνης για 24 ώρες οδηγεί σε κυτταρικό
θάνατο. Τα αποτελέσματα αυτά ενισχύουν την υπόθεση ότι τα μακροφάγα είναι ικανά
να παραλαμβάνουν την εξωκυττάρια ντοπαμίνη η οποία ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό
και τον κυτταρικό θάνατο στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος.
• Απομόνωση και βιοχημικός χαρακτηρισμός ενός αναστολέα της ενζυμικής
ενεργότητας της DDC από την κυτταρική σειρά U937
Η ύπαρξη του αναστολέα της ενζυμικής ενεργότητας της DDC στην κυτταρική σειρά
U937 διαπιστώθηκε για πρώτη φορά μετά από επώαση δειγμάτων ομογενοποιήματος της
κυτταρικής σειράς U937 παρουσία ομογενοποιήματος κυττάρων ΗΕK-293 που ως
γνωστόν έχει υψηλά επίπεδα ενεργότητας L-Dopa αποκαρβοξυλάσης. Κλασμάτωση του
ομογενοποιήματος κυττάρων U937 είχε ως αποτέλεσμα την ανάκτηση της ανασταλτικής
ενεργότητας μόνο στο διαλυτό κλάσμα υποδηλώνοντας την υποκυτταρική τοπολογία
του αναστολέα. Περαιτέρω μελέτη μέσω θερμοεπαγώμενου διαχωρισμού φάσεων
παρουσία του μη-ιονικού απορρυπαντικού Triton X-114 οδήγησε σε ανάκτηση της
ανασταλτικής ενεργότητας στην υδατική φάση του Triton X-114, επιβεβαιώνοντας
την υδρόφιλη φύση του. Κατεργασία του διαλυτού κλάσματος των μακροφάγων (ΔΚΜ)
με τις πρωτεάσες σερίνης, θρυψίνη, χυμοθρυψίνη και πρωτεϊνάση Κ, είχε ως
συνέπεια την πλήρη απώλεια της ανασταλτικής του δράσης, υποδηλώνοντας την
πρωτεϊνική φύση του αναστολέα της ενζυμικής ενεργότητας της DDC. Η πρωτεϊνική
φύση του ρυθμιστικού μορίου επιβεβαιώθηκε μετά από μελέτη επίδρασης της
ριβονουκλεάσης Α στην ανασταλτική ενεργότητα του ΔΚΜ. Η ανασταλτική δράση του
ΔΚΜ επηρεάζεται από παραμέτρους, όπως ο χρόνος επώασης, το pH, η θερμοκρασία
και η συγκέντρωση πρωτεΐνης. Με τη χρήση γενετικά τροποποιημένων κυτταρικών
σειρών ως μοντέλα παραγωγής DDC και alt-DDC υποδεικνύεται ότι το ΔΚΜ αναστέλλει
την ενζυμική ενεργότητα τόσο της πλήρους μήκους DDC, όσο και της alt-DDC. Η
απομόνωση του αναστολέα από την κυτταρική σειρά U937 πραγματοποιήθηκε
ακολουθώντας ένα πρωτόκολλο το οποίο περιλαμβάνει έξι στάδια καθαρισμού.
Αρχικά, πραγματοποιήθηκε κλασμάτωση ομογενοποιήματος κυττάρων U937 και
απομόνωση του διαλυτού κλάσματος. Δείγματα διαλυτού κλάσματος υπέστησαν
κατεργασία με θειικό αμμώνιο και εν συνεχεία τα προϊόντα της αντίδρασης
διαχωρίστηκαν σε υδρόφοβη στήλη phenyl sepharose. Ο αναστολέας απομονώθηκε μετά
από ανάλυση των πρωτεϊνών που δεν προσδέθηκαν στη στήλη σε μη αποδιατακτικό
πήκτωμα πολυακρυλαμίδης δύο διαστάσεων και συνεπακόλουθο διαχωρισμό και
εκχύλιση των πρωτεϊνών από το πήκτωμα. Το πρωτόκολλο απομόνωσης είχε σαν
αποτέλεσμα τον καθαρισμό του αναστολέα κατά 4.761 φορές. Η μοριακή μάζα του
αναστολέα υπολογίστηκε ίση με 67 kDa, μετά από ανάλυση των δειγμάτων σε SDS
πήκτω
μα πολυακρυλαμίδης. Η ανασταλτική δράση του καθαρού αναστολέα της ενεργότητας
της DDC επηρεάζεται από παραμέτρους, όπως ο χρόνος επώασης, το pH, η
θερμοκρασία και η συγκέντρωση πρωτεΐνης. Πειράματα κινητικής ανάλυσης της
αναστολής της ενεργότητας της DDC από τον καθαρό αναστολέα έδειξαν ότι ο τύπος
της αναστολής είναι μη συναγωνιστικός με τιμή της σταθεράς Ki στα 10,59 μM.
Ανάλυση των καθαρών δειγμάτων μέσω φασματομετρίας μάζας οδήγησαν στην
ταυτοποίηση του αναστολέα ως αλβουμίνη του ορού. Η οριστική επιβεβαίωση της
ταυτοποίησης του αναστολέα πραγματοποιήθηκε με τον έλεγχο επίδρασης υψηλής
καθαρότητας ανθρώπινης αλβουμίνης ορού στην ενζυμική ενεργότητα DDC κυττάρων
ΗΕΚ-293. Η αλβουμίνη του ανθρώπινου ορού, αναστέλλει την ενζυμική ενεργότητα
της DDC όλων των υποκυτταρικών κλασμάτων της κυτταρικής σειράς U937. Με τη
χρήση γενετικά τροποποιημένων κυτταρικών σειρών ως μοντέλα παραγωγής DDC και
alt-DDC υποδεικνύεται ότι η ανθρώπινη αλβουμίνη ορού αναστέλλει την ενζυμική
ενεργότητα τόσο της πλήρους μήκους DDC, όσο και της alt-DDC.
Η απομόνωση και ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της αλβουμίνης του ορού ως αναστολέα
της ενζυμικής ενεργότητας της L-Dopa αποκαρβοξυλάσης παρουσιάζει ιδιαίτερο
ενδιαφέρον διότι θα μπορούσε να εμβολιάσει νέες πειραματικές προσεγγίσεις οι
οποίες θα έχουν ως τελικό στόχο την ανάπτυξη νέων φαρμακολογικών και
θεραπευτικών μέσων για την καταπολέμηση νευροεκφυλιστικών και νεοπλασματικών
νόσων.
