Μελέτη των μονοπατιών των μικρών μορίων RNA στο μεταξοσκώληκα (Bombyx mori): μία in vitro και in vivo προσέγγιση

Διδακτορική Διατριβή uoadl:1309132 624 Αναγνώσεις

Μονάδα:
Τομέας Βιολογίας Κυττάρου Και Βιοφυσικής
Βιβλιοθήκη Σχολής Θετικών Επιστημών
Ημερομηνία κατάθεσης:
2016-07-20
Έτος εκπόνησης:
2016
Συγγραφέας:
Κολλιοπούλου Άννα
Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Δημήτριος Ι. Στραβοπόδης (Επιβλέπων), Επίκ. Καθηγητής ΕΚΠΑ, Luc Swevers, Ερευνητής Α’, Εργαστήριο Μοριακής Γενετικής Εντόμων & Βιοτεχνολογίας, Ινστιτούτο Βιοεπιστημών & Εφαρμογών, Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών (ΕΚΕΦΕ) «Δημόκριτος», Ισιδώρα Σ. Παπασιδέρη Καθηγήτρια ΕΚΠΑ
Πρωτότυπος Τίτλος:
Μελέτη των μονοπατιών των μικρών μορίων RNA στο μεταξοσκώληκα (Bombyx mori): μία in vitro και in vivo προσέγγιση
Γλώσσες διατριβής:
Ελληνικά
Μεταφρασμένος τίτλος:
Molecular dissection of small RNA pathways in the silkworm (Bombyx mori): an in vitro and in vivo approach
Περίληψη:
Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή εστιάζει στη μελέτη των μονοπατιών των μικρών
μορίων RNA στο μεταξοσκώληκα Bombyx mori, υπό το πρίσμα των παραγόντων που
επηρεάζουν την αποδοτικότητα του RNAi μηχανισμού. Οι παράγοντες που εξετάστηκαν
αφορούσαν κυρίως στην έκφραση γονιδίων-κλειδιών του RNAi μηχανισμού και στην
ύπαρξη ιϊκής μόλυνσης (εμμένουσας ή παθογόνου), ενώ ακόμα έγιναν αναφορές στους
μηχανισμούς της ενδογενούς φυσικής ανοσίας και της ικανότητας πρόσληψης dsRNA
από το εξωκυττάριο μέσο. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων προέκυψαν σημαντικά
συμπεράσματα σχετικά με την επίδραση των προαναφερθέντων παραγόντων στην
αποδοτικότητα του μηχανισμού του RNAi στο μεταξοσκώληκα.
Από τη λειτουργική ανάλυση της απόκρισης του RNAi μηχανισμού στα κύτταρα Bm5
προέκυψαν στοιχεία που συνηγορούν υπέρ της πιθανής αλληλοεπικάλυψης, υπό τις
κατάλληλες προϋποθέσεις, μονοπατιών καλά χαρακτηρισμένων σε άλλα έντομα (π.χ.
Drosophila), όπως το miRNA, το siRNA και το piRNA. Συγκεκριμένα, αναδεικνύονται
τέσσερα βασικά γονίδια που συμμετέχουν στη διαδικασία της αποσιώπησης μέσω
dsRNA στο μεταξοσκώληκα in vitro: το BmAgo1 του miRNA μονοπατιού, τα
BmDcr2/BmAgo2 του siRNA μονοπατιού και το BmAgo3 του piRNA μονοπατιού. Η
εμπλοκή των γονιδίων BmDcr2 και BmAgo2 ήταν αναμενόμενη λόγω της διαθέσιμης
βιβλιογραφίας που αφορά στη Drosophila. Ωστόσο, η ανάδειξη του BmAgo3 στην
αποσιώπηση μέσω μορίων dsRNA, και όχι ssRNA, ώθησε την παρούσα μελέτη στην
ανάγκη να αναλυθεί μεθοδικότερα ο ρόλος των δύο βασικών γονιδίων του piRNA
μονοπατιού στον B. mori.
Από τα δεδομένα που προέκυψαν, το BmAgo3 φαίνεται να εμπλέκεται σε ένα
δυναμικό δίκτυο μαζί με άλλα γονίδια (π.χ. BmAgo2, BmeIF-4E1 και BmHSP90) που
θεωρούνται σημαντικά για την εύρυθμη λειτουργία του RNAi στο μεταξοσκώληκα,
δίνοντας με αυτόν τον τρόπο περισσότερες αποδείξεις για την εν δυνάμει
συνεργατική δράση των μονοπατιών siRNA και
piRNA. Βέβαια, ενώ το γονίδιο BmAgo3 έχει ουσιαστικό ρόλο στο RNAi, η έκφρασή
του σε φυσιολογικά επίπεδα δεν είναι απαραίτητη τουλάχιστον για την επιβίωση
κυττάρων μεταξοσκώληκα όπου είναι μονίμως κατασταλμένο κατά τα 2/3 της
φυσιολογικής έκφρασής του μέσω δράσης μίας ειδικά σχεδιασμένης RNA φουρκέτας.
Στον αντίποδα, σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, το γονίδιο BmAub δε θεωρείται
σημαντικό για τη γονιδιακή αποσιώπηση μέσω RNAi, όμως πιθανώς να είναι κρίσιμο
για τη βιωσιμότητα των κυττάρων μεταξοσκώληκα, καθώς ήταν ανέφικτο να
επιτευχθεί κυτταρική σειρά όπου θα ήταν μόνιμα κατασταλμένο.
Εν συνεχεία, γνωρίζοντας ότι τα κύτταρα Bm5 είναι δεκτικά στην πρόκληση
γονιδιακής αποσιώπησης μέσω dsRNA έπειτα από διαμόλυνση, επιχειρήθηκε να
διερευνηθεί, επιπροσθέτως, η ικανότητα πρόσληψης dsRNA από το εξωκυττάριο
περιβάλλον διαμέσου κάποιου πιθανώς άγνωστου καναλιού μεταφοράς dsRNA, σύμφωνα
με το πρότυπο δράσης της πρωτεΐνης SID-1 στο Νηματώδη σκώληκα Caenorhabditis
elegans. Ωστόσο, ορισμένα προκαταρκτικά πειράματα εμβαπτισμού κυττάρων σε μέσο
που περιείχε dsRNA δεν έδειξαν σημαντική επίδραση στην έκφραση του εκάστοτε
γονιδίου-στόχου, ενώ η έκφραση των παραγόντων BmR2D2 και BmTranslin2 δε φάνηκε
να βελτιώνει την ικανότητα πρόσληψης dsRNA από τα κύτταρα και άρα την απόδοση
της γονιδιακής αποσιώπησης έπειτα από τον εμβαπτισμό.
Ακολούθως, μελετήθηκε η επίδραση των επιπέδων έκφρασης ορισμένων RNAi
παραγόντων του B. mori σε μία ιϊκή μόλυνση που αφορά σε κύτταρα Λεπιδοπτέρων.
Σε μία εμμένουσα μόλυνση κυττάρων μεταξοσκώληκα (Bm5) από τον RNA ιό BmMLV
δείχθηκε ότι η μόνιμη καταστολή της έκφρασης του piRNA γονιδίου BmAgo3 ευνοεί
την αύξηση των ιϊκών επιπέδων. Αντίστροφα, στην περίπτωση οξείας μόλυνσης
κυττάρων Spodoptera frugiperda (Sf21) με τον ανασυνδυασμένο DNA ιό AcMNPV-EYFP,
η ετερόλογη έκφραση των γονιδίων BmR2D2 και BmTranslin2 οδηγεί σε μείωση της
ιϊκής ανάπτυξης εντός των κυττάρων και σε ταυτόχρονη αύξηση της συγκέντρωσης
των ιϊκών σωματίων στο εξωκυττάριο μέσο. Ακόμη, είναι ενδιαφέρον ότι στα ίδια
κύτταρα η καταστολή των Ago3 και Aub μέσω ειδικών RNA φουρκετών ευνοεί την
ανάπτυξη του AcMNPV-EYFP. Συνεπώς, προκύπτει ότι ορισμένοι siRNA και piRNA
παράγοντες ελέγχουν κρίσιμες λειτουργίες που σχετίζονται με την εξέλιξη μίας
ιϊκής μόλυνσης εντός των κυττάρων των Λεπιδοπτέρων.
Με σκοπό να συσχετιστεί περαιτέρω ο RNAi μηχανισμός με τις ιϊκές μολύνσεις,
διερευνήθηκε επίσης η δυνατότητα του RNA ιού BmCPV να αυτορρυθμίζει τα επίπεδα
των γονιδίων του μέσω έκφρασης από το ίδιο το γονιδίωμά του πρόδρομων
microRNAs. Όπως έχει ήδη δειχθεί, ο συγκεκριμένος ιός εκφράζει ένα pre-miRNA
που στοχεύει στο τμήμα S10 του γονιδιώματος που κωδικοποιεί για την πολυεδρίνη,
το οποίο μπορεί να ρυθμίζει τα επίπεδα της συγκεκριμένης πρωτεΐνης. Στην
παρούσα εργασία, ελέγχθηκε εάν η έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης VP1
ρυθμίζεται από την έκφραση του pre-miRNA S1.2, όμως τα αποτελέσματα δεν
οδήγησαν σε σαφή συμπεράσματα, καθώς τα επίπεδα της πρωτεϊνικής έκφρασης είτε
δεν επηρεάστηκαν, είτε αυξήθηκαν από την παρουσία του pre-miRNA S1.2.
Στη συνέχεια, η ανακάλυψη της ύπαρξης εμμένουσας μόλυνσης από τον ιό BmCPV
στην αποικία μεταξοσκωλήκων του στελέχους Daizo που διατηρείτο στο εργαστήριό
μας αξιοποιήθηκε καταλλήλως, ούτως ώστε να μελετηθεί η επίδρασή της σε μία
παθογόνο μόλυνση με τον ίδιο ιό. Η ύπαρξη εμμένουσας μόλυνσης, η οποία
προηγείται της παθογόνου, δε φαίνεται να επηρεάζει σημαντικά την αντιϊκή
απόκριση κατά του BmCPV, όπως προκύπτει από τη σύγκριση με προϋπάρχουσες
σχετικές μελέτες στη βιβλιογραφία. Από τη μελέτη αυτή είδαμε ότι η μεταγραφική
απόκριση στο μεσέντερο του μεταξοσκώληκα έναντι της παθογόνου μόλυνσης με τον
BmCPV είναι μία σύνθετη διαδικασία στην οποία εμπλέκεται πλήθος διαφορετικών
μηχανισμών, μεταξύ των οποίων αυτός του RNAi (π.χ. BmDcr2, BmAgo2 και
BmeIF-4E1) και, σε μικρότερο βαθμό, ο αντίστοιχος της ενδογενούς φυσικής
ανοσίας. Άλλωστε, αναφορικά με τον RNAi μηχανισμό, στην παρούσα μελέτη, έχει
δειχθεί ότι τα γονίδια BmDcr2 και BmAgo2, υπό φυσιολογικές συνθήκες,
παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση στο μεσέντερο σε σχέση με ιστούς που δεν
αποτελούν φυσική πύλη εισόδου παθογόνων στο σώμα του ζώου, όπως είναι η
επιδερμίδα. Εκτός των προαναφερθέντων μηχανισμών, στην απόκριση έναντι του
BmCPV εμπλέκονται, επίσης, γονίδια που ελέγχουν κυτταρικές διαδικασίες όπως η
ανοσολογική απόκριση, πρωτεόλυση, απόπτωση, αποτοξίνωση, ορμονική σηματοδότηση,
έκδυση, αντιγραφή DNA και το στρες. Τέλος, η ανίχνευση ιϊκών μικρών RNAs
(vsRNAs) μεγέθους 20 νουκλεοτιδίων μέσω αλληλούχισης νέας γενιάς (NGS: next
generation sequencing) αποτελεί ισχυρή απόδειξη της ενεργοποίησης του RNAi
μηχανισμού ως άμυνα κατά της ιϊκής μόλυνσης με τον BmCPV, είτε αυτή πρόκειται
για εμμένουσα, είτε για παθογόνο μορφή.Τα ευρήματά μας αποκαλύπτουν πιθανή
αλληλοεπικάλυψη των βασικών μονοπατιών του RNAi στο μεταξοσκώληκα in vitro,
κατά την πρόκληση γονιδιακής αποσιώπησης μέσω dsRNA (miRNA, siRNA και piRNA), ή
μέσω φουρκέτας RNA (siRNA και piRNA). Επιπλέον, πέραν της εμπλοκής τους στο
μηχανισμό γονιδιακής αποσιώπησης μέσω dsRNA, τα γονίδια BmDcr2 και BmAgo2 του
μονοπατιού siRNA αναδεικνύονται ως καίριοι παράγοντες για το μεσέντερο του
μεταξοσκώληκα, τόσο υπό φυσιολογικές συνθήκες, όσο και υπό συνθήκες ιϊκής
μόλυνσης (BmCPV). Όμως, και το γονίδιο BmAgo3 του piRNA μονοπατιού φαίνεται να
συνιστά σημαντικό παράγοντα που επηρεάζει την αποδοτικότητα του RNAi μηχανισμού
στο μεταξοσκώληκα, ενώ μπορεί επίσης μαζί με τους παράγοντες BmR2D2 και
BmTranslin2, και ενδεχομένως και τον BmAub, να διαδραματίσει κρίσιμο ρόλο για
την αντιϊκή απόκριση (BmMLV και AcMNPV) στα Λεπιδόπτερα. Ακόμη, η παρουσία μίας
εμμένουσας μόλυνσης δε φαίνεται να επιδρά αρνητικά στην αποδοτικότητα του RNAi
μηχανισμού (BmMLV) και στην αντιϊκή προστασία του μεταξοσκώληκα (BmCPV). Τέλος,
τα κλασσικά μονοπάτια της ενδογενούς φυσικής ανοσίας του B. mori δεν
αποκρίνονται έντονα κατά τη διάρκεια της αντιϊκής προστασίας (BmCPV), και κατά
συνέπεια δε φαίνεται να αλληλεπιδρούν σημαντικά με τον RNAi μηχανισμό, ούτως
ώστε να επηρεάζουν την αποδοτικότητά του. Ωστόσο, από την παρούσα έρευνα
αναδεικνύονται νέα γονίδια που ενδεχομένως διαθέτουν στρατηγικής σημασίας
ρόλους για την αντιϊκή απόκριση του μεταξοσκώληκα σε συνδυασμό με τη δράση του
RNAi μηχανισμού.
Λέξεις-κλειδιά:
Λεπιδόπτερα, RNA παρεμβολή, Μικρά RNA, Ιός BmCPV, Εμμένουσα μόλυνση
Ευρετήριο:
Όχι
Αρ. σελίδων ευρετηρίου:
0
Εικονογραφημένη:
Ναι
Αρ. βιβλιογραφικών αναφορών:
633
Αριθμός σελίδων:
xxii, 373