Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Παναγιώτα Παπαζαφείρη, Λεωνίδας Στεφανής, Κωνσταντίνος Βεκρέλλης (επιβλέπων)
Περίληψη:
Η α-συνουκλεΐνη είναι μία κυτταρικά άφθονη πρωτεΐνη του κυτοσολίου, η οποία
εκτελεί σημαντικές λειτουργίες σε προσυναπτικά νευρωνικά άκρα. Έχει συνδεθεί
άμεσα βιοχημικά και γενετικά με ιδιοπαθείς και οικογενείς μορφές της νόσου του
Parkinson.Η νόσος του Parkinson είναι μία προοδευτική νευροεκφυλιστική ασθένεια
η οποία χαρακτηρίζεται από την εξάπλωση πρωτεϊνικών εγκλείστων, κύριο συστατικό
των οποίων είναι η α-συνουκλεΐνη. Τα τελευταία έτη, πληθώρα ευρημάτων συνηγορεί
υπέρ του ότι η α-συνουκλεΐνη έχει παρακρινείς τοξικές δράσεις. Η α-συνουκλεΐνη
εκκρίνεται μέσω μη-κλασικών κυτταρικών μονοπατιών τα οποία δεν έχουν ακόμη
ταυτοποιηθεί πλήρως. Πρόσφατα δείχθηκε ότι ένα από αυτά είναι η έκκριση της
μέσω των εξωσωμάτων, κυστιδίων που έχουν ενδοκυτταρική βιογένεση και
συγκεκριμένα βιοχημικά και μορφολογικά χαρακτηριστικά. Τα εξωσώματα
συγκεντρώνουν μεγάλο επιστημονικό ενδιαφέρον ως λειτουργικοί μεσολαβητές της
διακυτταρικής επικοινωνίας. Πρωτεΐνες οι οποίες σχετίζονται με
νευροεκφυλιστικές νόσους, όπως το αμυλοειδές β και η α-συνουκλεΐνη, έχει
δειχθεί ότι εκκρίνονται μέσω των εξωσωμάτων. Βάσει αυτού έχει δημιουργηθεί η
υπόθεση ότι τα εξωσώματα δρουν ως «Δούρειοι Ίπποι» μεταφέροντας τοξικές
πρωτεΐνες σε υγιή κύτταρα.
Στην παρούσα μελέτη προσεγγίζεται για πρώτη φορά το πρότυπο έκκρισης της α-
συνουκλεΐνης υπό φυσιολογικές συνθήκες και υπό συνθήκες που μιμούνται τη νόσο
του Parkinson. Αρχικά, διερευνήθηκε η τοπολογία της φυσιολογικής έκκρισης της α-
συνουκλεΐνης σε διαμερισματοποιημένες καλλιέργειες φλοιικών νευρώνων.
Βελτιστοποιήθηκε η καλλιέργεια νευρώνων σε συσκευές που επιτρέπουν το
διαχωρισμό των νευρωνικών σωμάτων από τους άξονες. Η μέτρηση της α-συνουκλεΐνης
έγινε με μία υπερ-ευαίσθητη ELISA η οποία έχει αναπτυχθεί στο εργαστήριό μας.
Εν συνεχεία εξετάσθηκε πώς ο φυσιολογικός μηχανισμός έκκρισης της πρωτεΐνης
αλλάζει υπό συνθήκες που μιμούνται παθολογικές καταστάσεις σχετιζόμενες με τη
νόσο του Parkinson. Χρησιμοποιήθηκαν δύο συστήματα επαγόμενης έκφρασης της
αγρίου τύπου και της Α53Τ μεταλλαγμένης μορφής της α-συνουκλεΐνης. Μελετήθηκε
ξεχωριστά αλλά και συγκριτικά η έκκριση της α-συνουκλεΐνης σε ελεύθερη μορφή
και σε σύνδεση με τα εξωσώματα. Προς την κατεύθυνση αυτή, βελτιστοποιήθηκαν δύο
ευαίσθητες ποσοτικές μέθοδοι για τη μέτρηση των εξωσωμάτων –η micro-Bradford
και η δοκιμασία εστεράσης κατά Ellman. Χρησιμοποιώντας τις μεθόδους αυτές
συμπληρωματικά ήταν εφικτή η σύγκριση του αριθμού των εξωσωμάτων που
εκκρίνονται από συγκεκριμένο αριθμό κυττάρων και ο υπολογισμός της α-
συνουκλεΐνης που περιέχεται στον ίδιο αριθμό εξωσωμάτων από κάθε συνθήκη.
Τέλος, βελτιστοποιήθηκε ένα πρωτόκολλο σήμανσης των εξωσωμάτων για την μελέτη
των κινητικών χαρακτηριστικών της πρόσληψής τους.
Η α-συνουκλεΐνη εκκρίνεται φυσιολογικά από τα σώματα και τους άξονες των
νευρώνων. Η εξωκυττάρια πρωτεΐνη διακρίνεται σε ελεύθερη μορφή και σε σύνδεση
με τα εξωσώματα. Ενδοκυττάρια επαγωγή της έκφρασης της α-συνουκλεΐνης οδήγησε
σε πολύ μεγάλη αύξηση και σε παρόμοια επίπεδα έκκρισης της ελεύθερης α-
συνουκλεΐνης, τόσο της αγρίου τύπου όσο και της Α53Τ μεταλλαγμένης μορφής.
Επομένως η μετάλλαξη δεν επηρεάζει, στο κυτταρικό μας μοντέλο, το πρότυπο
έκκρισης της πρωτεΐνης. Στις συνθήκες αυτές, ο αριθμός των εξωσωμάτων παραμένει
σταθερός, ωστόσο ο ίδιος αριθμός εξωσωμάτων περιέχει μεγαλύτερο φορτίο α-
συνουκλεϊνης. Και στην περίπτωση αυτή, η μετάλλαξη δεν επηρεάζει το πρότυπο
έκκρισης. Ιδιαίτερα σημαντικό εύρημα ήταν ότι τα εξωσώματα δεν είναι ο κύριος
μηχανισμός μέσω του οποίου η πρωτεΐνη εξέρχεται από το κύτταρο στις
πειραματικές συνθήκες που εξετάστηκαν. Τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι άλλοι
μηχανισμοί ενεργοποιούνται για την έκκριση της πρωτεΐνης όταν τα ενδοκυτταρικά
επίπεδα είναι αυξημένα. Ωστόσο το ερώτημα του αν τα εξωσώματα αποτελούν
σημαντικό μηχανισμό μέσω του οποίου τοξικές μορφές απομακρύνονται από το
κύτταρο παραμένει αναπάντητο. Τέλος, δείχθηκε ότι τα εξωσώματα προσλαμβάνονται
από διαφοροποιημένα κύτταρα και πρωτογενείς νευρώνες και ότι η πρόσληψη
εξελίσσεται στο χρόνο.
Τα ευρήματα της παρούσας εργασίας προτείνουν ότι η διατήρηση της ισορροπίας της
α-συνουκλεΐνης εντός και εκτός κυττάρου είναι ένας πολλά υποσχόμενος
θεραπευτικός στόχος κατά της εξάπλωσης της παθολογίας Parkinson. Τα εξωσώματα,
θα μπορούσαν να αποτελέσουν τους πλέον κατάλληλους φορείς στοχευμένης θεραπείας
λόγω της ιδιότητάς τους να διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη και να παραδίδουν
λειτουργικά το φορτίο τους.
Λέξεις-κλειδιά:
Νόσος του Πάρκινσον, α-συνουκλεΐνη, Πρότυπο έκκρισης, εξωσώματα, νευρικά κύτταρα
