Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Ευρύκλεια Λιανίδου, Καθηγήτρια Ε.Κ.Π.Α. Επιβλέπουσα, Γεωργία Σωτηροπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Πανεπιστήμιο Πατρών, Χρήστος Κρούπης, Επίκουρος Καθηγητής, Ε.Κ.Π.Α
Περίληψη:
Οι μεταλλάξεις στο γενετικό υλικό είναι συνδεδεμένες με τη βιολογία του
καρκίνου και συνεπώς η ανίχνευσή τους αποτελεί ένα από τα πιο σημαντικά σημεία
του συγκεκριμένου ερευνητικού πεδίου.
Στην παρούσα εργασία, έγινε προσπάθεια ανάπτυξης μιας μεθόδου ανίχνευσης
μεταλλάξεων υψηλής ευαισθησίας και ειδικότητας, επιλέγοντας από ένα ευρύ φάσμα
μεθοδολογιών που είναι αυτή τη στιγμή διαθέσιμες στη διεθνή βιβλιογραφία.
Απώτερος στόχος είναι η ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο PIK3CA, το οποίο έχει
εμπλακεί γενικά στην καρκινογένεση και ιδιαιτέρως στον καρκίνο του μαστού.
Σε πρώτη φάση ελέχθηκαν δείγματα γενωμικού DNA από κυκλοφορούντα καρκινικά
κύτταρα, δείγματα cDNA καθώς και δείγματα cell free DNA από υγιείς αιμοδότες
(24, 20, 12, αντίστοιχα), από ασθενείς με καρκίνο του μαστού με διάγνωση
μετάστασης (34, 10, 45, αντίστοιχα), καθώς και ασθενείς με καρκίνο του μαστού
μετά το χειρουργείο και προ επικουρικής θεραπείας (60, 56, 25, αντίστοιχα). Η
μεθοδολογία του χρησιμοποιήθηκε είχε απαπτυχθεί στο εργαστήριό μας και
βασίζεται στην ανάλυση υψηλής διακριτικότητας καμπυλών τήξεως (HRMA)1. Τα
αποτελέσματα έδειξαν ότι στα δείγματα cell free DNA το 20% των ασθενών με
μετάσταση και το 12% των ασθενών προ επικουρικής θεραπείας έφεραν τη μετάλλαξη
στο εξόνιο 20. Επίσης, στα δείγματα γενωμικού DNA από κυκλοφορούντα καρκινικά
κύτταρα το 3% των ασθενών με καρκίνο του μαστού προ επικουρικής θεραπείας
έφεραν τη μετάλλαξη αυτή. Αντίθετα, στα δείγματα cDNA δε βρέθηκε θετικό
αποτέλεσμα σε καμία κατηγορία δειγμάτων.
Στη συνέχεια αναπτύχθηκε η μεθοδολογία της ARMS-PCR και συμπληρωματικά ο
συνδυασμός της με την ανάλυση καμπυλών τήξεως HRMA παρουσία προϊόντος
εσωτερικού ελέγχου, εκτελώντας αντίδραση Real-time PCR. Μετά την απαραίτητη
βελτιστοποίηση των δύο μεθοδολογιών, αξιολογήθηκε η ορθότητα των αποτελεσμάτων
τους με εφαρμογή σε δείγματα DNA από ιστούς παραφίνης τα οποία είχαν ελεγχθεί
με την τεχνολογία του DNA Sequencing. Στη συνέχεια ελέγχθηκε η ευαισθησία των
δύο μεθόδων με την εφαρμογή τους σε μία σειρά μειγμάτων φυσιολογικού και
μεταλλαγμένου αλληλίου σε διαφορετικά ποσοστά.
Λέξεις-κλειδιά:
PIK3CA, HRMA, ARMS-PCR, CTCs, cfDNA
