Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Ντια Γαλανοπούλου Καθηγήτρια (Επιβλέπουσα), Κωνσταντίνος Βοργιάς Καθηγητής, Δημήτρης Χατζηνικολάου Επίκ. Καθηγητής
Περίληψη:
Η χιτίνη είναι ένας πολυσακχαρίτης που αποτελείται από κατάλοιπα N-ακετυλο-
γλυκοζαμίνης (GlcNAc) τα οποία συνδέονται μεταξύ τους με β-1-4-γλυκοζιτικούς
δεσμούς. Μετά την κυτταρίνη, αποτελεί τον δεύτερο σε αφθονία πολυσακχαρίτη στη
φύση. Μελέτες δείχνουν ότι το Serattia marcescens είναι από τους πιο
αποτελεσματικούς μικροοργανισμούς για την αποικοδόμηση της χιτίνης. Τα ένζυμα
που διασπούν τη χιτίνη σε αυτόν τον μικροοργανισμό είναι οι χιτινάσες, η
χιτοβιάση και η GBP21. Οι διάφορες κατηγορίες χιτινασών αποικοδομούν την χιτίνη
παράγοντας ολιγοσακχαρίτες και διμερή (GlcNAc)2 . Το τελικό στάδιο της
αποικοδόμησης πραγματοποιείται από τη χιτοβιάση που υδρολύει τον β-1,4
γλυκοζιτικό δεσμό του διμερούς και άλλων ολιγοσακχαριτών με αποτέλεσμα την
παραγωγή μονομερών GlcNAc. Η χιτοβιάση είναι μια μονομερής πρωτεΐνη (98.5 kDa)
που αποτελείται από τέσσερις δομικά αυτοτελείς περιοχές (domains). Η ώριμη
πρωτεΐνη φέρει τρεις δισουλφιδικούς δεσμούς που σταθεροποιούν το μόριο, ενώ δεν
χρειάζεται συμπαράγοντες, προσδέτες ή μέταλλα για να είναι λειτουργική. Η
καταλυτική της περιοχή ανήκει στην οικογένεια 20 των γλυκοζιδικών υδρολασών.
(GH20). Η χιτοβιάση εμφανίζει σημαντική δομική ομολογία με την ανθρώπινη
εξοζαμινιδάση, η οποία ανήκει στην ίδια οικογένεια, και έχει συσχετιστεί με
ασθένειες όπως η Tay-Sachs και η Sandoff. Η ομοιότητα αυτή αποτέλεσε το έναυσμα
για την χρήση της χιτοβιάσης ως μοριακού μοντέλου για την ανθρώπινη
εξοζαμινιδάση. Στην παρούσα εργασία παρουσιάζεται η τρισδιάστατη δομή της
χιτοβιάσης καθώς και η δομή της παρουσία των τριών αναστολέων, παραγώγων
GlcNAc, για τους οποίους έχουν ήδη πραγματοποιηθεί οι κινητικές μελέτες για την
διευκρίνηση της ανασταλτικής τους δράσης. Αναπτύχθηκαν εκ νέου κρύσταλλοι της
χιτοβιάσης στη φυσική διαμόρφωση, σε νέες συνθήκες από τις προηγούμενα
δημοσιευμένες, παρουσία PEG3350 και κιτρικού νατρίου. Στη συνέχεια συλλέχθηκαν
δεδομένα περίθλασης με χρήση συγχροτρονικής ακτινοβολίας σε υψηλή ευκρίνεια και
για τα τρία παράγωγα με τη μορφή συμπλόκου με το ένζυμο αλλά και για το ένζυμο
στη φυσική του διαμόρφωση, σε διακριτική ικανότητα 1.31 A. Όλες οι νέες
κρυσταλλικές δομές που προέκυψαν ανήκαν στην ομάδα χώρου συμμετρίας P21 και τα
μόρια είχαν διαφορετική διευθέτηση στο χώρο έναντι της αναμενόμενης από την ήδη
γνωστή δ
ομή (ομάδα χώρου συμμετρίας P21212). Η νέα δομή χρησιμοποιήθηκε για τον
προσδιορισμό των συμπλόκων χιτοβιάση:ένωση 1, 2, 3. Και οι τρεις προσδέτες
βρέθηκε ότι συνδέονται κατά μήκος του (βα)8-βαρελιού της ενεργής περιοχής του
ενζύμου. Οι μεν δύο εξ αυτών (ενώσεις 1,3) δεν προκαλούν μεταβολές στο
καταλυτικό κέντρο γεγονός που αντανακλάται στην ισχυρή αναστολή που
επιδεικνύουν στη δράση της χιτοβιάσης. Ο τρίτος αναστολέας είναι πολύ
ασθενέστερος και αντίθετα με τους άλλους δύο αλλάζει τη διαμόρφωση ενός εκ των
καταλυτικών αμινοξέων κατά τη σύνδεσή του. Στην περίπτωση της ένωσης 3,
παρατηρείται ένα επιπλέον μόριο προσδέτη στη διεπιφάνεια μεταξύ δύο συμμετρικών
μορίων της χιτοβιάσης προκαλώντας επιμήκυνση της μιας εκ των τριών διαστάσεων
της μοναδιαίας κυψελίδας κατά ~6 . Συγκριτικές μελέτες για την αποτύπωση της
ομολογίας της χιτοβιάσης με την ανθρώπινη εξοζαμινιδάση έδειξαν ότι τόσο τα δύο
καταλυτικά αμινοξέα των ενζύμων όσο και αμινοξέα που συνθέτουν την ευρύτερη
περιοχή του καταλυτικού κέντρου διατηρούνται και στα δύο ένζυμα. Τα αμινοξέα
αυτά ενδεχομένως να ευνοούν τον προσανατολισμό των ολιγοσακχαριτών στο
καταλυτικό κέντρο. Μελέτες της δομικής ομολογίας που παρουσιάζουν τα δύο ένζυμα
έδειξαν ότι η χιτοβιάση και η ανθρώπινη β-εξοζαμινιδάση επιδεικνύουν z-score
~35 που αντιστοιχεί σε υψηλή συμφωνία γεγονός που επιβεβαιώνει τις προσπάθειες
που έχουν γίνει έως σήμερα να αξιοποιηθεί η χιτοβιάση ως μοντέλο για την
καλύτερη κατανόηση της δομής-δράσης της ανθρώπινης εξοζαμινιδάσης. Επιπρόσθετα,
αναζητήθηκαν άλλες ομόλογες πρωτεΐνες τόσο σε επίπεδο ακολουθίας όσο και σε
επίπεδο τρισδιάστατης δομής της χιτοβιάσης. Η έρευνα που αφορά στη χιτοβιάση
και τον S. marcescens παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον κι αυτό γιατί η καλύτερη
κατανόηση του καταλυτικού μηχανισμού δράσης του ενζύμου θα μπορούσε να οδηγήσει
στην αξιοποίησή του για βιοτεχνολογικές εφαρμογές με εκμετάλλευση του ρόλου του
στην επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό του μικροοργανισμού.
Λέξεις-κλειδιά:
Χιτοβιάση, Χιτίνη, Ν-ακετυλο-γλυκοζαμίνη, Εξοζαμινιδάση, Κρυσταλλογραφία Ακτίνων-Χ
