Περίληψη:
Εισαγωγή – σκοπός: Σκοπός της παρούσης εργασίας ήταν η ανάπτυξη και η επικύρωση
καινοτόμων και αξιόπιστων μεθόδων για τη μελέτη της DNA μεθυλίωσης του πρώτου
υποκινητή του ογκοκατασταλτικού RASSF1 γονιδίου (από τον οποίο μεταγράφεται το
κυριότερο μετάγραφο στον μαστό, το RASSF1A) και της mRNA έκφρασής του και η
αξιολόγησή τους σε ασθενείς με καρκίνο μαστού.
Υλικά και μέθοδοι: Αναλύθηκε DNA και RNA από 81 παγωμένους ιστούς ασθενών με
καρκίνο του μαστού και γνωστά κλινικά /ιστοπαθολογανατομικά δεδομένα (ηλικία,
μέγεθος όγκου, ιστολογική διάγνωση, grade, λεμφαδενική διήθηση, μετάσταση, ER,
PR, HER2 υποδοχείς) και από 4 φυσιολογικούς ιστούς μαστού γυναικών. Οι ασθενείς
επιλέχθηκαν με βάση τη διαθεσιμότητα του υλικού και την ύπαρξη >70% καρκινικών
κυττάρων στην ταχεία βιοψία. Η ανίχνευση της μεθυλίωσης του πρώτου υποκινητή
του RASSF1 γονιδίου έγινε με την μέθοδο του Pyrosequencing στον αναλυτή
PyroMark Q96 (Qiagen), όπου αναλύθηκαν συνολικά 9 CpG δινουκλεοτίδια σε 117 bp
της 1ης CpG νησίδας του RASSF1 γονιδίου που εκτείνεται στον πρώτο υποκινητή.
Για τη μελέτη της mRNA έκφρασης χρησιμοποιήθηκε η real-time RT-qPCR στο θερμικό
κυκλοποιητή Rotor-Gene Q με το SYBR Green PCR kit και το κατάλληλο σετ
προτυποποιημένων εκκινητών της Qiagen με το οποίο ανιχνεύονται όλα τα RASSF1
μετάγραφα (A-H). Ως μέθοδος σχετικής ποσοτικοποίησης χρησιμοποιήθηκε η 2-ΔCt
(RQ = 2-ΔCt, όπου RQ η mRNA έκφραση) με γονίδιο αναφοράς τη β2-μικροσφαιρίνη.
Για την στατιστική ανάλυση, χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό IBM SPSS Statistics
version 21.
Αποτελέσματα: Αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν οι δύο μέθοδοι ανάλυσης RASSF1
έκφρασης με επιτυχία. Ως όριο της μεθυλίωσης ορίστηκε το 57,09% (από τον μέσο
όρο των φυσιολογικών + 2SD), λαμβάνοντας υπόψη ότι ανιχνεύθηκε background
μεθυλίωσης και στα φυσιολογικά δείγματα. Με τον τρόπο αυτό, χαρακτηρίσθηκαν ως
υπο-μεθυλιωμένα τα 59 (72,8%) ενώ ως υπερ-μεθυλιωμένα τα 22 δείγματα (27,2%).
Ακόμα, αφού υπολογίστηκε η διάμεσος των τιμών mRNA έκφρασης των δειγμάτων
(RQ*1000=2,27) χαρακτηρίσθηκαν τα 40 δείγματα (49,4%) ως υπερ-εκφραζόμενα ενώ
τα 41 (50,6%) ως υπο-εκφραζόμενα. Από τη στατιστική ανάλυση προέκυψε ότι δε
βρέθηκε στατιστικώς σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ της μεθυλίωσης και της
mRNA έκφρασης (p=0,207), δεδομένο που ενισχύεται με την αδυναμία εύρεσης ενός
μοντέλου γραμμικής παλινδρόμησης, βάσει του οποίου θα μπορούσε να υπολογισθεί η
mRNA έκφραση από την μεθυλίωση. Ακόμη, βρέθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά
του μέσου όρου της μεθυλίωσης ανάλογα με την κατάσταση των ER υποδοχέων, με
στάθμη εμπιστοσύνης 95% (t-test, p=0,001), το οποίο επιβεβαιώνεται με το
χωρισμό σε ομάδες και έλεγχο χ2-test (p=0,016). Οριακά συσχετίζονται η RASSF1
υπερ-μεθυλίωση με την θετικότητα των PR υποδοχέων (χ2, p=0,06) και την
λεμφαδενική διήθηση (χ2, p=0,07). Από την λογαριθμιστική παλινδρόμηση για την
λεμφαδενική διήθηση, βρέθηκε ότι η πιθανότητα λεμφαδενικής διήθησης αυξάνεται
με την παρουσία αρνητικών ER υποδοχέων (p=0,008 με RR 0,09-C.I. 0,14-0,52), το
ποσοστό της RASSF1 μεθυλίωσης (p=0,006 με RR 7,96-C.I. 1,82-34,86) και το
επίπεδο έκφρασης του RASSF1 (p=0,047 με RR 3,94-C.I. 1,02-15,29). Από την
ανάλυση επιβίωσης προέκυψε ότι μεταξύ εμφάνισης μετάστασης και mRNA υπερ-
έκφρασης του RASSF1 γονιδίου υπάρχει στατιστικώς σημαντική συσχέτιση (log rank
test, p= 0,040).
Συμπεράσματα: Με βάση τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής, η υπερμεθυλίωση του
πρώτου υποκινητή του RASSF1 γονιδίου μπορεί να οδήγησε σε αύξηση της έκφρασης
άλλων μεταγράφων από τον δεύτερο υποκινητή με αρνητική προγνωστική σημασία για
τις ασθενείς. Η αναπτυχθείσα μέθοδος ανίχνευσης μεθυλίωσης λοιπόν θα μπορούσε
μελλοντικά να επεκταθεί με ανάλογα αξιόπιστο τρόπο και στο δεύτερο υποκινητή
του RASSF1 γονιδίου, ώστε να υπάρχει μια συνολική εικόνα της ενεργότητας των
υποκινητών του. Όσον αφορά την μελέτη mRNA έκφρασης, ένας νέος σχεδιασμός της
μεθόδου με χρήση probes ειδικών για όλα τα RASSF1 μετάγραφα σε συνδυασμό με
ειδικά αντισώματα για την ανίχνευση των διαφόρων πρωτεϊνικών ισομορφών
απευθείας στον ιστό (με IHC ή Western Blot) -και πιο ειδικά του RASSF1A-, θα
μπορέσουν να εξειδικεύσουν την μελέτη αυτή, ξεπερνώντας τα υπάρχοντα προβλήματα
και να προσφέρουν επιπρόσθετα χρήσιμα προβλεπτικά και προγνωστικά εργαλεία για
την παρακολούθηση και θεραπεία των ασθενών με καρκίνο μαστού.
