Παραγωγή ανασυνδυασμένης ηπατιδίνης και μελέτη της έκφρασης του γονιδίου της σε ηπατικά κύτταρα παρουσία της καψιδιακής πρωτεΐνης του ιού της ηπατίτιδας C

Διπλωματική Εργασία uoadl:1319313 351 Αναγνώσεις

Μονάδα:
Κατεύθυνση Βιοχημεία
Βιβλιοθήκη Σχολής Θετικών Επιστημών
Ημερομηνία κατάθεσης:
2016-10-21
Έτος εκπόνησης:
2016
Συγγραφέας:
Γιαννημάρας Διονύσιος
Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Ν. Γαλανοπούλου, Καθηγήτρια ΕΚΠΑ
Πρωτότυπος Τίτλος:
Παραγωγή ανασυνδυασμένης ηπατιδίνης και μελέτη της έκφρασης του γονιδίου της σε ηπατικά κύτταρα παρουσία της καψιδιακής πρωτεΐνης του ιού της ηπατίτιδας C
Γλώσσες εργασίας:
Ελληνικά
Μεταφρασμένος τίτλος:
Production of recombinant hepcidin and study of her gene expression in liver cells in the presence of the hepatitis C virus core protein
Περίληψη:
Η ηπατιδίνη (HAMP) είναι μία πεπτιδική ορμόνη 25 αμινοξέων, υπεύθυνη για την
ρύθμιση της ομοιόστασης του σιδήρου στον οργανισμό, μέσω αποικοδόμησης του
μοναδικού γνωστού κυτταρικού εξαγωγέα σιδήρου, της φερροπορτίνης. Η παρούσα
διπλωματική εργασία παρουσιάζει τις προσπάθειες να παραχθεί ανασυνδυασμένη
ηπατιδίνη σε μονομερή μορφή και να διερευνηθεί η πιθανή ρύθμιση της γονιδιακής
έκφρασης της ηπατιδίνης από τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV), κατά την HCV μόλυνση
του ήπατος. Η διπλωματική εργασία χωρίζεται σε δύο μέρη.
Στο πρώτο μέρος έγινε παραγωγή του ανασυνδυασμένου μορίου Hep25-His, το οποίο
φέρει ετικέτα έξι ιστιδινών (6Ηis-tag), σε διαλυτή μορφή στο ευκαρυωτικό
σύστημα του ζυμομύκητα P. pastoris. Η Hep25-His χρησιμοποιήθηκε για τον
ποσοτικό προσδιορισμό της ηπατιδίνης σε καλλιέργειες ηπατικών κυττάρων.
Παράλληλα, διερευνήθηκε ο ρόλος της λυοφιλοποίησης στην παρατηρούμενη
δημιουργία συσσωματωμάτων κατά την απομόνωσή του. Κατά την προσπάθεια
απομόνωσης της ανασυνδυασμένης μορφής Hep25 με τη βοήθεια μονοκλωνικών
αντισωμάτων, προέκυψαν δυσκολίες στην απομόνωση της μονομερούς μορφής με
χρωματογραφία μοριακής διήθησης. Γι'αυτό διερευνήθηκε ο όγκος έκλουσης των
άλλων ενώσεων του δείγματος, ελέγχθηκε η στήλη με πρότυπα διαλύματα πρωτεϊνών
και δοκιμάστηκε η απομόνωση της Hep25 με κινητή φάση υψηλής αλατότητας.
Στο δεύτερο μέρος μελετήθηκε η έκφραση του γονιδίου της ηπατιδίνης σε ηπατικά
κύτταρα HepG2 παρουσία της ιικής καψιδιακής πρωτεΐνης (HCV core), η οποία είναι
μία πλειοτροπική πρωτεΐνη με σημαντικό ρόλο στον κύκλο ζωής του ιού. Σε ηπατικά
κύτταρα HepG2 που υπερεκφράζουν την καψιδιακή πρωτεΐνη, μετρήθηκαν τα επίπεδα
mRNA του γονιδίου hamp, καθώς και τα επίπεδα της εκκρινόμενης ηπατιδίνης, με
RT-qPCR και ανταγωνιστική ELISA, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν αύξηση της
μεταγραφής της ηπατιδίνης παρουσία της καψιδιακής πρωτεΐνης του ιού HCV.
Ταυτόχρονα, μελετήθηκε η έκφραση σημαντικών σιδηρορυθμιστικών πρωτεϊνών με
ανάλυση κατά Western. Παρατηρήθηκε αύξηση της αποθήκης του σιδήρου φερριτίνης
και μείωση της έκφρασης της φερροπορτίνης (Fpn), της ματριπτάσης-2 (TMPRSS6)
και του υποδοχέα της τρανσφερίνης τύπου 1 (TfR1). Με χρήση ειδικών αναστολέων,
η μελέτη της ρύθμισης της έκφρασης του γονιδίου hamp από την καψιδιακή πρωτεΐνη
έδειξε ότι ενεργοποιούνται τα σηματοδοτικά μονοπάτια BMP/SMAD και STAT3. Στην
ενεργοποίηση των μονοπατιών αυτών συμμετέχει η κινάση CK2.
Λέξεις-κλειδιά:
ανασυνδυασμένη ηπατιδίνη, γονίδιο hamp, καψιδιακή πρωτεΐνη, ηπατίτιδα C, κινάση CK2
Ευρετήριο:
Ναι
Αρ. σελίδων ευρετηρίου:
15,16,17,130,131
Εικονογραφημένη:
Ναι
Αρ. βιβλιογραφικών αναφορών:
163
Αριθμός σελίδων:
146

document.pdf
3 MB
Δεν επιτρέπεται η πρόσβαση στο αρχείο έως 2019-10-21.