Περίληψη:
Η ανθρώπινη ιντερφερόνη IFNα2b, είναι ένας ευρέως χρησιμοποιούμενος
αντιικόςπαράγοντας, ο οποίος παράγεται στη βιομηχανία έως σήμερα από το
βακτήριο E.coli.
Ως προκαρυώτης, η Escherichia coli δεν έχει την ικανότητα να γλυκοσυλιώσει την
ιντερφερόνη. Προκειμένου να έχει τον απαιτούμενο χρόνο ημιζωής στο αίμα των
ασθενών η ιντερφερόνη IFNα2b γλυκοσυλιώνεται in vitro (προσθήκη πολυαιθυλενο-
γλυκόλης). Έχει γίνει πλήθος προσπαθειών παραγωγής της από άλλα συστήματα
έκφρασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, χωρίς όμως επιτυχία σε επίπεδο
ανταγωνιστικότητας παραγωγής σε βιομηχανική κλίμακα.Τα μικροφύκη είναι μια
πολυποίκιλη ομάδα φωτοσυνθετικών μικροοργανισμών με
σημαντικές βιοτεχνολογικές δυνατότητες που τα καθιστούν ελκυστικά συστήματα
έκφρασης φαρμακευτικών και βιοτεχνολογικών πρωτεϊνών. Το χλωροφύκος
Chlamydomonas reinhardtii, όντας το φύκος-πρότυπο για μοριακές, βιοχημικές και
γενετικές μελέτες για πάνω από 60 χρόνια, διαθέτει την πιο εξελιγμένη μοριακή
και
γενετική εργαλειοθήκη ανάμεσα στα μικροφύκη. Μερικά από τα πλεονεκτήματά του
είναι η γρήγορη ανάπτυξη, η ευκολία στο χειρισμό, η δυνατότητα αύξησης της
κλίμακας παραγωγής σε βιοαντιδραστήρες, το χαμηλό κόστος καλλιέργειας και το
γεγονός ότι θεωρείται ένας ασφαλής μικροοργανισμός (GRAS). Επιπλέον, η έκφραση
ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών από τον πυρήνα του C.reinhardtii περιλαμβάνει τα
πλεονεκτήματα των ευκαρυωτικών συστημάτων έκφρασης, όπως η επαγόμενη
έκφραση του διαγονιδίου, η αποτελεσματική αναδίπλωση σύνθετων πρωτεϊνών, ο
υποκυτταρικός εντοπισμός και η έκκριση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, καθώς και οι
μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. Στην παρούσα εργασία έγινε προσπάθεια
έκφρασης της IFNα2b από τον πυρήνα
του C.reinhardtii. Το βελτιστοποιημένο γονίδιο της ανθρώπινης IFNα2b για το
C.reinhardtii κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pChlamy_1, με τον οποίο
μετασχηματίστηκαν κύτταρα αγρίου τύπου C.reinhardtii, με τη μέθοδο της
ηλεκτροπόρωσης. Οι μετασχηματισμένες αποικίες που προέκυψαν ύστερα από
επιλογή στο αντιβιοτικό υγρομυκίνη Β, ελέγχθηκαν για την ενσωμάτωση του
γονιδίου της IFNα2b με τη μέθοδο colony PCR. Στη συνέχεια, απομονώθηκε το
mRNA των θετικών αποικιών και ανιχνεύθηκε η έκφραση του γονιδίου ifn α2b με τη
μέθοδο real-time PCR. Από την αντίδραση αυτή προέκυψαν 3 αποικίες με υψηλά
επίπεδα έκφρασης του mRNA της IFNα2b. Τα αποτελέσματα της εργασίας ήταν
ενθαρρυντικά για περαιτέρω μελέτη του παραπάνω συστήματος.
Λέξεις-κλειδιά:
Ιντερφερόνη α2b, Chlamydomonas reinhardtii, Έκφραση , Μετασχηματισμός χλωροφύκους, Χλωροφύκος
