Διερεύνηση των επιπέδων έκφρασης microRNAs στον ορό ασθενών με επιληψία

Διπλωματική Εργασία uoadl:1506210 431 Αναγνώσεις

Μονάδα:
Κατεύθυνση Κλινική Βιοχημεία - Μοριακή Διαγνωστική
Βιβλιοθήκη Σχολής Θετικών Επιστημών
Ημερομηνία κατάθεσης:
2017-05-04
Έτος εκπόνησης:
2017
Συγγραφέας:
Παπαγρηγορίου Μαρία-Ελένη
Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Δ. ΣΙΔΕΡΗΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ
A. ΣΚΟΡΙΛΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ
Δ. ΒΑΣΙΛΑΚΟΠΟΥΛΟΥ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ, ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ
Πρωτότυπος Τίτλος:
Διερεύνηση των επιπέδων έκφρασης microRNAs στον ορό ασθενών με επιληψία
Γλώσσες εργασίας:
Ελληνικά
Μεταφρασμένος τίτλος:
Διερεύνηση των επιπέδων έκφρασης microRNAs στον ορό ασθενών με επιληψία
Περίληψη:
ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΕΚΦΡΑΣΗΣ MicroRNAs ΣΤΟΝ ΟΡΟ
ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΕΠΙΛΗΨΙΑ
Παπαγρηγορίου Μαρία Ελένη, Βιολόγος, Πανεπιστημίου Πατρών
ΠΕΡΙΛΗΨΗ
Η επιληψία ορίζεται ως η διαταραχή του εγκεφάλου που χαρακτηρίζεται
από τη διαρκή προδιάθεση για την εμφάνιση επιληπτικών κρίσεων και από τις
νευροβιολογικές, γνωστικές, ψυχολογικές και κοινωνικές συνέπειες αυτής της
κατάστασης, σύμφωνα με τη Διεθνή Ένωση κατά της Επιληψίας (International
League Against Epilepsy - ΙLAE) το 2005. Πρόσφατα ωστόσο (ΙLAE 2014),
διατυπώθηκε και ένας δεύτερος ορισμός με βάση τον οποίο επιληψία είναι η
ασθένεια του εγκεφάλου, η οποία ορίζεται από οποιαδήποτε από τις ακόλουθες
συνθήκες: i) ιστορικό δύο τουλάχιστον επεισοδίων σπασμών με περισσότερες από
24 ώρες διαφορά μεταξύ τους, ii) ένα απρόκλητο επεισόδιο σπασμών και η
πιθανότητα περαιτέρω επεισοδίων με τον κίνδυνο επανεμφάνισης να αγγίζει
τουλάχιστον το 60% μετά από δύο απρόκλητα επεισόδια σπασμών, που μπορεί
να συμβούν μέσα στα επόμενα 10 χρόνια και iii) διάγνωση ενός επιληπτικού
συνδρόμου. Η επιληψία αποτελεί μία από τις παλαιότερες καταστάσεις που έχει
γνωρίσει η ανθρωπότητα, η οποία επηρεάζει άτομα όλων των ηλικιών.
Υπολογίζεται ότι περίπου 50.000.000 άτομα παγκοσμίως έχουν διαγνωσθεί με
επιληψία με συχνότητα εμφάνισης 24-53/100.000 σε άτομα στις αναπτυγμένες
χώρες, αποτελώντας έτσι μία από τις πιο κοινές νευρολογικές διαταραχές σε
παγκόσμιο επίπεδο.
Τα miRNAs είναι μία κατηγορία μικρών μη κωδικών μορίων, τα οποία
ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση εμποδίζοντας τη διαδικασία της πρωτεϊνικής
έκφρασης και κατ’ επέκταση της μετάφρασης κυρίως με την πρόσδεσή τους στην
3’ αμετάφραστη περιοχή του mRNA στόχου. Η απορρύθμισή τους έχει συνδεθεί
με ένα μεγάλο αριθμό σημαντικών ασθενειών στον ανθρώπινο οργανισμό,
ανάμεσα στις οποίες συγκαταλέγεται και η επιληψία. Τα miRNAs εκφράζονται σε
μεγάλο βαθμό στον ανθρώπινο εγκέφαλο σε σχέση με άλλα όργανα. Έχουν
103
παρατηρηθεί αλλαγές στα επίπεδα των miRNAs του εγκεφάλου μετά από
παρατεταμένη επιληπτική κρίση (SE) σε πειραματικά μοντέλα. Παθολογικές
διαδικασίες που διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στην επιληψία, όπως ο νευρωνικός
θάνατος, η φλεγμονή και η γλοίωση βρίσκονται υπό τον έλεγχο των miRNAs.
Εντοπίζονται σε ένα ευρύ φάσμα ιστών και εξωκυττάριων υγρών, όπως ο ορός και
το πλάσμα του αίματος και έτσι μπορούν να αξιοποιηθούν κλινικά ως νέοι
βιοδείκτες για την επιληπτογένεση ή ακόμα και για την πρόγνωση της επιληψίας.
Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη και βελτιστοποίηση
νέων μοριακών μεθοδολογιών προσδιορισμού των επιπέδων των hsa-miR-34a και
hsa-miR-146a σε δείγματα ορού ασθενών με επιληψία. Χρησιμοποιήθηκαν για το
λόγο αυτό οι καρκινικές κυτταρικές σειρές DU145, BT-20, AGS και DLD-1, καθώς
και 24 δείγματα ορού ασθενών με φαρμακοανθεκτική επιληψία και 24 δείγματα
ορού ασθενών που δεν εμφανίζουν φαρμακοανθεκτική επιληψία. Το πειραματικό
πρωτόκολλο περιλαμβάνει την απομόνωση ολικού RNA, την αντίδραση
αντίστροφης μεταγραφής (Reverse Transcription/RT) του RNA σε cDNA με χρήση
ειδικών για τα miRNA-στόχους stem-loop εκκινητές (miRNA-specific primers) και
ποσοτικοποίηση των cDNA μορίων με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης
πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qReal – time PCR) με χρήση miRNA-ειδικών
TaqMan-MGB ανιχνευτών (TaqMan-MGB probes). Ως ενδογενής μάρτυρας
χρησιμοποιήθηκε cel-miR-39.
Ο έλεγχος της απόδοσης της μεθοδολογίας μας πραγματοποιήθηκε αρχικά
με εφαρμογή single miR-specific reverse transcription (μονή miR-ειδικής
αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής) και έπειτα με multiple miR-specific reverse
transcription (πολλαπλή miR-ειδικής αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής) για τα
cel-miR-39, hsa-miR-146a και hsa-miR-34a στις τέσσερις κυτταρικές σειρές της
μελέτης μας. Παρατηρήθηκε ικανοποιητική ενίσχυση των μορίων-στόχων μας,
τόσο από τη χρήση της single- ,όσο και από της multiple- miR-specific reverse
transcription, όπως και η απουσία φαινομένων αναστολής στις qPCR αντιδράσεις.
Ωστόσο, ο έλεγχος των NCrev.transc. ανέδειξε την ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων,
ειδικά στην περίπτωση του hsa-miR-34a απαιτώντας την περαιτέρω
βελτιστοποίηση των μεθόδων.
Για τη μείωση της παραγωγής του μη ειδικού προϊόντος στη μεθοδολογία
προσδιορισμού του hsa-miR-34a ακολούθησε βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης
104
των miR-ειδικών RT εκκινητών στην αντίδραση αντίστροφης μεταγραφή και οι
εικόνες των καμπυλών ενίσχυσης σε όλες τις συγκεντρώσεις που
χρησιμοποιήθηκαν (200nM-10nM) ήταν ικανοποιητικές. Εντούτοις ο έλεγχος των
NCrev.transc. ανέδειξε και εδώ την ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων κατά την
μεθοδολογία προσδιορισμού του hsa-miR-34a οδηγώντας μας στο συμπέρασμα
ότι απαιτείται περαιτέρω βελτιστοποίηση των μεθόδων.
Ακολούθησαν λοιπόν βελτιστοποιήσεις πρώτα της συγκέντρωσης του
universal ανάστροφου R εκκινητή και έπειτα του πρόσθιου F εκκινητή στη realtime
qPCR αντίδραση, με στόχο τη μείωση παραγωγής μη ειδικού προϊόντος στη
μεθοδολογία προσδιορισμού του hsa-miR-34a. Και στις δύο περιπτώσεις
επιβεβαιώθηκε η ικανότητα προσδιορισμού του hsa-miR-34a σε όλο το εύρος των
χρησιμοποιούμενων συγκεντρώσεων, ενώ ως προς την παραγωγή μη ειδικού
προϊόντος παρατηρήθηκε σημαντική μείωσή του.
Ο έλεγχος της απόδοσης της μεθοδολογίας μας συνεχίστηκε για τα
δείγματα ορού ασθενών με επιληψία και την κυτταρική σειρα DU145, με εφαρμογή
multiple miR-specific reverse transcription (πολλαπλή miR-ειδικής αντίδρασης
αντίστροφης μεταγραφής και χρήση συγκέντρωσης RT εκκινητών 20 nM ανά
αντίδραση όσο και 10 nM ανά αντίδραση για τα cel-miR-39, hsa-miR-146a και hsamiR-
34a. Η απόδοση της μεθόδου μας ήταν ικανοποιητική και για τις δύο
συγκεντρώσεις. Για το hsa-miR-146a, παρατηρήσαμε την ικανοποιητική ενίσχυση
του hsa-miR-146a στο σύνολο των δειγμάτων ορού και την κυτταρική σειρα
DU145, ενώ για το hsa-miR-34a παρατηρήθηκαν καμπύλες ενίσχυσης στο σύνολο
των ελεγχθέντων δειγμάτων σε σχετικά μεγάλες τιμές CT αναδεικνύοντας, είτε τη
μικρή συγκέντρωσή του στον ορό των ασθενών, είτε τη μη ικανοποιητική απόδοση
της μεθοδολογίας προσδιορισμού μας. Ο έλεγχος των NCrev.transc. δειγμάτων μας,
ανέδειξε την ενίσχυση και μη ειδικού προϊόντος και επομένως την ανάγκη για
περαιτέρω βελτιστοποίηση.
Μετά από τον έλεγχο της μεθοδολογίας μας σε σύνολο 20 δειγμάτων ορού
ασθενών με επιληψία επιβεβαιώθηκε η ικανοποιητική απόδοσή του σε μεγαλύτερο
αριθμό δειγμάτων ακολουθώντας την ίδια μεθοδολογία προσδιορισμού με πριν.
‘Όμως η σημαντική ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων σε παρόμοια επίπεδα με την
ενίσχυση του hsa-miR-34a στα δείγματα, ανέδειξε την απουσία ειδικότητας στη
μεθοδολογία μας και γι’ αυτό αποφασίστηκε ο σχεδιασμός και η σύνθεση νέων
105
miR-34a-ειδικών stem-loop RT εκκινητών και πρόσθιου (F) εκκινητή της real - time
qPCR αντίδρασης. Ο νέος miR-34a-ειδικός stem-loop RT εκκινητής δε βελτίωσε
την εικόνα σχηματισμού μη ειδικών προϊόντων της μεθόδου, όπως φάνηκε από
τον έλεγχο των NCrev.transc. δειγμάτων του. Με το νέο πρόσθιο (F) εκκινητή για το
hsa-miR-34a δεν παρατηρήθηκε καμπύλη ενίσχυσης στα δείγματα ορού της
μελέτης μας και έτσι συμπεραίνουμε ότι δεν αποδίδει στη συγκεκριμένη
περίπτωση.
Συνοπτικά, αναπτύξαμε κι επικυρώσαμε τη μεθοδολογία για την
ποσοτικοποίηση του hsa-miR-146a σε δείγματα ορού ασθενών με επιληψία,
χρησιμοποιώντας το cel-miR-39 ως γονίδιο αναφοράς για σκοπούς
κανονικοποίησης. Η ανάπτυξη ειδικής μεθόδου προσδιορισμού για το hsa-miR-
34a δεν ήταν ικανοποιητική. Απαιτούνται μελλοντικές μελέτες με μεγαλύτερο
αριθμό ασθενών, ώστε να βελτιωθεί η εγκυρότητα για την έκφρασή του σε
δείγματα ορού ασθενών με επιληψία.
Κύρια θεματική κατηγορία:
Θετικές Επιστήμες
Λέξεις-κλειδιά:
Διερεύνηση, επίπεδα έκφρασης, microRNAs, ορός ασθενών, επιληψία
Ευρετήριο:
Όχι
Αρ. σελίδων ευρετηρίου:
0
Εικονογραφημένη:
Ναι
Αρ. βιβλιογραφικών αναφορών:
357
Αριθμός σελίδων:
139
ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ 2017-ΠΑΠΑΓΡΗΓΟΡΙΟΥ ΜΑΡΙΑ ΕΛΕΝΗ.pdf (2 MB) Άνοιγμα σε νέο παράθυρο