Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Δημήτριος Μπούμπας, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Δημήτριος Βλαχάκος, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Ιωάννης Μπολέτης, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Δημήτριος Βασιλόπουλος, Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική σχολή, ΕΚΠΑ
Ειρήνη Γράψα, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Ιατρική σχολή, ΕΚΠΑ
Κλειώ Μαυραγάνη, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Ιατρική σχολή, ΕΚΠΑ
Αριστείδης Χαρώνης, Ερευνητής Α,ΙΙΒΕΑΑ
Περίληψη:
Ο Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος (ΣΕΛ) είναι το πρωτότυπο συστημικό χρόνιο αυτοάνοσο νόσημα που χαρακτηρίζεται από απώλεια ανοχής στα πυρηνικά αντιγόνα εαυτού, παθολογικές απαντήσεις Β και Τ λεμφοκυττάρων και εναπόθεση ανοσοσυμπλεγμάτων σε διάφορα όργανα όπως, δέρμα, αρθρώσεις, νεφρούς και νευρικό σύστημα. Τα τελευταία χρόνια η θνητότητα έχει βελτιωθεί όμως, ακόμα παραμένει υψηλότερη σε σχέση με τη θνητότητα του γενικού πληθυσμού. Η παθογένειά του είναι πολύπλοκη και, παρά τις εντατικές ερευνητικές προσπάθειες ακόμα παραμένει αδιευκρίνιστη. Θεωρείται ότι, ο ΣΕΛ προκαλείται από αλληλεπίδραση γενετικών, επιγενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων. Σκοπός της μελέτης ήταν η περαιτέρω διερεύνηση των παθογενετικών μηχανισμών του ΣΕΛ μέσω συγκριτικής μελέτης μεταγραφώματος των ζωικών προτύπων λύκου NZB/W-F1 και των υγιών προτύπων C57BL/6, χρησιμοποιώντας τεχνικές αλληλούχησης RNA νέας γενεάς (RNA-sequencing).
Θηλυκά NZB/W-F1 ζωικά πρότυπα λύκου θυσιάστηκαν στο στάδιο προ-εφηβίας (κατά το οποίο απουσιάζουν οι ορμόνες του φύλου), στο στάδιο προ-αυτοανοσίας (κατά το οποίο απουσιάζουν τα αυτοαντισώματα) και στο στάδιο της νεφρίτιδας (όπου η πρωτεϊνουρία είναι>300mg/dl). Οι μύες C57BL/6 χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα ελέγχου. Αφαιρέθηκαν σπλήνας (περιφερικό λεμφικό όργανο), νεφροί και εγκέφαλος (τελικά όργανα-στόχοι) και, απομονώθηκε RNA. Ακολούθησε αλληλούχηση RNA νέας γενεάς στην πλατφόρμα Illumina HiSeq 2000. Υπολογίστηκαν επίπεδα έκφρασης RNA, διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια (ΔΕΓ) (FC>1.5, p<0.05) και, με το Ingenuity Pathway Analysis αναζητήθηκαν κανονικές οδοί, ανοδικοί ρυθμιστές και κυριότερα υπερεκφραζόμενα ή υποεκφραζόμενα μόρια. Για να μελετηθεί η γενετική ευπάθεια του ΣΕΛ, έγινε συγκριτική μελέτη μεταγραφώματος ίδιων οργάνων, μεταξύ NZB/W-F1 και C57BL/6, ίδιας ηλικίας, σε διαφορετικά στάδια του νοσήματος. Στα στάδια προ-εφηβίας, προ-αυτοανοσίας και νεφρίτιδας διαπιστώθηκαν στο σπλήνα 693, 289 και 89 ΔΕΓ, στο νεφρό 63, 930 και 21 ΔΕΓ και, στον εγκέφαλο 2, 2 και 5 ΔΕΓ, αντίστοιχα. Για να μελετηθεί η οργανοειδικότητα του ΣΕΛ στο χρόνο, έγινε συγκριτική μελέτη μεταγραφώματος διαφορετικών οργάνων των NZB/W-F1 υβριδίων λύκου κατά το ίδιο στάδιο του νοσήματος. Κατά το στάδιο της προ-εφηβίας, διαπιστώθηκαν 3304 ΔΕΓ μεταξύ του εγκεφάλου και του νεφρού, 4808 ΔΕΓ μεταξύ εγκεφάλου και σπλήνα και, 3279 ΔΕΓ μεταξύ νεφρού και σπλήνα. Κατά το στάδιο της προ-αυτοανοσίας διαπιστώθηκαν 2036 ΔΕΓ μεταξύ του εγκεφάλου και του νεφρού, 4483 ΔΕΓ μεταξύ εγκεφάλου και σπλήνα και, 1781 ΔΕΓ μεταξύ νεφρού και σπλήνα. Στο στάδιο της νεφρίτιδας, διαπιστώθηκαν 3550 ΔΕΓ μεταξύ εγκεφάλου και νεφρού, 4810 ΔΕΓ μεταξύ εγκεφάλου και σπλήνα και 3267 ΔΕΓ μεταξύ νεφρού και σπλήνα. Για να διαπιστωθεί η αναπτυξιακή βιολογία του ΣΕΛ έγινε συγκριτική μελέτη μεταγραφώματος ίδιων οργάνων, ίδιων ζωικών προτύπων, σε διαφορετικά στάδια του νοσήματος. Στο σπλήνα, στον εγκέφαλο και στο νεφρό των NZB/W-F1 υβριδίων λύκου διαπιστώθηκαν 277, 12 και 1 ΔΕΓ μεταξύ του σταδίου της προ-εφηβίας και του σταδίου της προ-αυτοανοσίας; 212, 6 και 8 ΔΕΓ μεταξύ του σταδίου της νεφρίτιδας και του σταδίου της προ-εφηβίας; και 15, 6 και 2 ΔΕΓ μεταξύ του σταδίου της νεφρίτιδας και του σταδίου της προ-αυτοανοσίας, αντίστοιχα.
Για να επιλεγεί μία οδός προς περαιτέρω μελέτη, αναζητήθηκαν στα δεδομένα της ανάλυσης νέες κανονικές οδοί που συμμετέχουν στα ζωικά πρότυπα λύκου, τόσο στο περιφερικό λεμφικό όργανο όσο και σε τελικό όργανο-στόχο του νοσήματος. Στα ζωικά πρότυπα λύκου στο στάδιο της νεφρίτιδας διαπιστώνεται η συμμετοχή της κανονικής οδού της ενεργοποίησης της εξωγενούς οδού της πήξης, τόσο στο σπλήνα όσο και στο νεφρό. Είναι γνωστό ότι, στη σήψη ο ιστικός παράγοντας (TF), -ο κυριότερος in vivo ενεργοποιητής της εξωγενούς οδού της πήξης αλλά ταυτόχρονα, μέσω υποδοχέων PAR, ενεργοποιητής της φλεγμονής- εξωκυτταρώνεται από τα ουδετερόφιλα πάνω στις εξωκυττάριες παγίδες ουδετεροφίλων (ΝΕΤs). Προηγούμενες μελέτες μας με μικροσυστοιχίες cDNA από μυελό των οστών και miRNA από περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα αίματος ασθενών με ενεργό και ανενεργό ΣΕΛ έδειξαν ότι, οι ασθενείς με ενεργό ΣΕΛ χαρακτηρίζονται από μία γονιδιακή ταυτότητα ουδετεροφίλων αλλά και από διαταραχή γονιδίων και miRNA που ρυθμίζουν την αυτοφαγία. Αναζητήθηκε στη βάση δεδομένων που δημιουργήθηκε η εμπλοκή γονιδίων αυτοφαγίας και ουδετεροφίλων στο ζωικό πρότυπο λύκου στα διάφορα στάδια του νοσήματος. Παρατηρήθηκε ότι, στο σπλήνα των ζωικών προτύπων λύκου, γονίδια αυτοφαγίας και ουδετεροφίλων είναι διαφορικά εκφραζόμενα σε σχέση με το σπλήνα υγιών προτύπων και στα τρία στάδια του νοσήματος. Επομένως, ετέθη η επιστημονική υπόθεση ότι, η επαγώμενη με αυτοφαγία μεταφορά του TF στα NETs μπορεί να αποτελεί το σύνδεσμο μεταξύ αυξημένης θρομβογένεσης και φλεγμονής που παρατηρούνται στους ασθενείς με ενεργό ΣΕΛ. Επόμενος στόχος της μελέτης ήταν η διερεύνηση του ρόλου των διακοσμημένων με TF NETs στο ΣΕΛ.
Απομονώθηκαν ορός και ουδετερόφιλα από υγιείς εθελοντές και ασθενείς με ενεργό ή ανενεργό ΣΕΛ. Έγιναν ex vivo καλλιέργειες ουδετεροφίλων και in vitro διεγέρσεις ή αναστολές τους. Αξιολογήθηκαν τα επίπεδα αυτοφαγίας, η ΝΕΤωση, η διακόσμηση των ΝΕΤs με τον TF και την προφλεγμονώδη IL-17 και, η προθρομβωτική δραστικότητα του TF των NETs. Ακολούθως, μελετήθηκαν νεφρικές τομές ασθενών με υπερπλαστική νεφρίτιδα λύκου ως προς την ύπαρξη NETs διακοσμημένων με TF και IL-17. Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση των ΝΕΤs από ασθενείς με ΣΕΛ στη μορφολογία ανθρώπινων ποδοκυττάρων. Τα αποτελέσματα της μελέτης ήταν τα εξής: τα ουδετερόφιλα των ασθενών με ΣΕΛ εμφανίζουν αυξημένα επίπεδα αυτοφαγίας σε σχέση με τα υγιή και, αυξημένη NETωση η οποία επάγεται από την αυτοφαγία. Βρέθηκε ότι, η αυτοφαγία επάγει τη μεταφορά TF στα NETs του ΣΕΛ, ο οποίος είναι προθρομβωτικός αφού παράγει θρομβίνη. Επίσης, τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι, ο ορός των ασθενών με ενεργό ΣΕΛ επάγει την αυτοφαγία και την εξαρτώμενη από αυτοφαγία ΝΕΤωση στα υγιή ουδετερόφιλα. Ταυτόχρονα, αυξάνει τα επίπεδα του TF στα υγιή ουδετερόφιλα και οδηγεί σε απελευθέρωση NETs διακοσμημένων με TF και IL-17. Όλα τα φαινόμενα που βρέθηκαν, αναστέλλονται από την υδροξυχλωροκίνη, που αποτελεί αναστολέα της αυτοφαγίας. Επίσης, η μελέτη αυτή έδειξε ότι, τα διακοσμημένα με TF και IL-17 NETs εναποτίθενται στο νεφρό ασθενών με υπερπλαστική νεφρίτιδα λύκου. Τέλος, η επώαση ανθρώπινων ποδοκυττάρων με δομές NETs από ασθενείς με ενεργό ΣΕΛ τροποποίησε τη μορφολογία των ποδοκυττάρων.
Συμπερασματικά, με συγκριτική μελέτη μεταγραφώματος ζωικού προτύπου λύκου χρησιμοποιώντας τεχνικές αλληλούχησης RNA νέας γενεάς, δημιουργήθηκε μία βάση δεδομένων μεταγραφώματος που χαρακτηρίζει τη γενετική ευπάθεια του ΣΕΛ, την οργανοειδικότητά του στο χρόνο και την αναπτυξιακή του βιολογία. Τα ευρήματα αποτελούν υποψήφιους βιοδείκτες εξέλιξης του νοσήματος και προσβολής των οργάνων και, υποψήφιους θεραπευτικούς στόχους στο ΣΕΛ. Η συνέχεια της μελέτης στον άνθρωπο έδειξε ότι, τα NETs αποτελούν ικρυώματα συσσώρευσης βιοδραστικών παραγόντων, μεταξύ των οποίων ο TF και η IL-17, που παραμένουν στον ιστό ακόμα και απουσία ακέραιων ουδετεροφίλων. Η ενδοθηλίνη-1 και το C5a στον ορό των ασθενών με ΣΕΛ αποτελούν τους φλεγμονώδεις μεσολαβητές που ενεργοποιούν την οδό HIF-1/REDD1, η οποία αυξάνει την αυτοφαγία στα ουδετερόφιλα και την επαγώμενη από αυτή ΝΕΤωση. Τα διακοσμημένα με TF και IL-17 NETs αποτελούν το σύνδεσμο μεταξύ αυξημένης θρομβογένεσης και φλεγμονής που παρατηρούνται στους ασθενείς με σοβαρό ΣΕΛ και, εξηγούν μέρος της ευεργετικής δράσης που έχει η υδροξυχλωροκίνη στη νεφρίτιδα λύκου. Τέλος, διαπιστώθηκε ότι τα διακοσμημένα με TF και IL-17 NETs τροποποιούν το φαινότυπο ανθρώπινων ποδοκυττάρων και αυξάνουν την παραγωγή κολλαγόνου από τους ινοβλάστες. Περιγράφηκαν οι ανοδικοί ρυθμιστές και τα καθοδικά μόρια της ΝΕΤωσης στο ΣΕΛ και προτείνεται ένα μοντέλο πολλαπλών χτυπημάτων που χρήζει θεραπείας πολλαπλών στόχων, η οποία μπορεί να επιτευχθεί με επανατοποθέτηση φαρμάκων.
