Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Νικόλαος Θωμαΐδης, Αναπληρωτής Καθηγητής ΕΚΠΑ
Αντώνιος Καλοκαιρινός, Καθηγητής ΕΚΠΑ
Χαράλαμπος Προεστός, Επίκουρος Καθηγητής ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Μία νέα μέθοδος για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό 23 αμινοξέων αναπτύχθηκε με τη χρήση υγρoχρωματογραφίας συζευγμένης με διαδοχική φασματομετρία μάζας, με προοπτική την εφαρμογή της σε τρόφιμα για τον προσδιορισμό της ποιοτικής και ποσοτικής τους σύστασης σε ολικά αμινοξέα.
Συγκεκριμένα, για τον προσδιορισμό των αμινοξέων Αργινίνη (Arg), Ιστιδίνη (His), Λυσίνη (Lys), Θρυπτοφάνη (Trp), Γλυκίνη (Gly), Βαλίνη (Val), Αλανίνη (Ala), Λευκίνη (Leu), Ισολευκίνη (Ile), Θρεονίνη (Thr), Ασπαραγίνη (Asn), Ασπαραγινικό οξύ (Asp), Γλουταμίνη (Gln), Γλουταμινικό οξύ (Glu), Φαινυλαλανίνη, (Phe), γ-‘Αμινοβουτυρικό οξύ (GABA), Μεθειονίνη (Met), Κυστεϊνη (Cys), Σερίνη (Ser)΄, Φωσφοσερίνη (Pse), Ομοσερίνη (Hse), Προλίνη (Pro) και 4-Ύδροξυπρολίνη (Ηyp) προσδιορίσθηκαν οι βέλτιστες χρωματογραφικές συνθήκες με χρήση υγρoχρωματογραφίας υδρόφιλων αλληλεπιδράσεων (HILIC) και οι βέλτιστες συνθήκες ανίχνευσης με την τεχνική ιοντισμού με ηλεκτροψεκασμό σε τριπλό τετράπολο (ESI-MS/MS). Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με χρήση της επιλογής για θετικό ιονισμό και παρακολούθηση της επιλεγμένης αντίδρασης (SRM) με το πρώτο θραύσμα σε αφθονία (1st fragment) να χρησιμοποιείται ως ιόν ποσοτικοποίησης και το δεύτερο (2nd fragment) ως ιόν ταυτοποίησης.
Για το σκοπό αυτό εξετάστηκαν οι ακόλουθες φυσικοχημικές παράμετροι πρώτον, η επίδραση της στατικής φάσης στην κατακράτηση και το διαχωρισμό των αμινοξέων, δεύτερον, η επίδραση της συγκέντρωσης του ρυθμιστικού διαλύματος άλατος της κινητής φάσης, τρίτον, η επίδραση του pH της κινητής φάσης, και τέλος η επίδραση της θερμοκρασίας της στήλης. Τα βέλτιστα αποτελέσματα του συγκεκριμένου σχεδιασμού προσδιορίσθηκαν με κριτήριο την ένταση του σήματος των κορυφών των αμινοξέων, σε πρότυπα διαλύματα που παρασκευάζονταν πριν από κάθε ανάλυση. Η χρήση της στήλης ZIC HILIC έδωσε τα ακόλουθα αποτελέσματα πρώτον, καλό σήμα για τα περισσότερα αμινοξέα με οξείες κορυφές ακόμα και στα βασικά αμινοξέα His, Arg και Lys. που εκλούονται τελευταία δεύτερον, επετεύχθη ικανοποιητικός διαχωρισμός μεταξύ των ισομερών Leu και Ile και κατέστη δυνατή η ανίχνευση και η ποσοτικοποίηση της Cys.
Η νέα μέθοδος πλεονεκτεί ως προς τον χρόνο εκτέλεσης του προσδιορισμού και τον αριθμό των αμινοξέων που μπορούν να προσδιορισθούν ταυτόχρονα με αξιοπιστία.
