Περίληψη:
Οι μεταφορείς αποτελούν διαμεμβρανικές πρωτεΐνες για τη μεταφορά ουσιών από και προς το κύτταρο. Ειδικότερα, οι μεταφορείς φαρμακευτικών ενώσεων, προσφέρουν προστασία στον οργανισμό ξενιστή, διότι απoτελούν το συνδετικό κρίκο για τη μεταφορά των αντιμικροβιακών ουσιών από το μικροπεριβάλλον του ξενιστή, εντός του κυττάρου του μικροοργανισμού εισβολέα. Οι μεταφορείς άλλοτε αποτελούν στόχο για τη αντιμικροβιακή ένωση και άλλοτε αποτελούν τη δίοδο για την είσοδο αυτής εντός του κυττάρου στόχου. Παρά το πλεονέκτημα όμως, που θα μπορούσε να προσφέρει ο σχεδιασμός αντιμικροβιακών ουσιών με βάση τον επιθυμητό μεταφορέα στόχο, οι φαρμακοφόρες ουσίες επιλέγονται κυρίως βάσει της αποτελεσματικότητας έναντι της ασθένειας, καθώς και των λιγότερων παρενεργειών για τον ξενιστή και όχι με βάση την πύλη εισόδου.
Στην παρούσα μελέτη έγινε προσπάθεια να διερευνηθούν, για πρώτη φορά, οι πιθανοί μεταφορείς που εμπλέκονται στη συσσώρευση μιας ομάδας αντιμυκητιακών ενώσεων, που ονομάζονται αναστολείς της αφυδρογονάσης του ηλεκτρικού οξέως (Succinic Dehydrogenase Inhibitors ή SDHIs), εντός των κυττάρων του Aspergillus nidulans. Γενικότερα, οι ουσίες που ανήκουν στην εν λόγω ομάδα χαρακτηρίζονται ως αποτελεσματικές, έναντι αρκετών ειδών μυκήτων που προσβάλλουν καλλιεργήσιμα φυτά. Η χημική ένωση που επιλέχθηκε για περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού δράσης και ανθεκτικότητας, μεταξύ άλλων που ελέγχθηκαν για την αποτελεσματικότητά τους έναντι του Aspergillus nidulans, είναι η τελευταίας γενιάς ένωση που ανήκει στην ομάδα των SDHIs, το boscalid. Σημειώνεται ότι, οι πιο συνήθεις μηχανισμοί ανθεκτικότητας αντιμυκητιακών ενώσεων προκύπτουν είτε από υπερέκφραση ή τροποποίηση του στόχου, είτε από ενεργοποίηση μεταφορέων εκροής στα μελετώμενα στελέχη (από ABC ή MFS μεταφορείς).
Η τοξικότητα της χημικής ένωσης boscalid ελέγχθηκε στα διαφορετικά είδη του γένους Aspergillus, όπου η αποτελεσματικότητα του φαρμάκου διέφερε από είδος σε είδος. Παράλληλα, η φυλογενετική ανάλυση της πρωτεΐνης στόχου, για την εν λόγω ουσία, sdhB, δεν υπέδειξε συσχέτιση της αλληλουχίας της πρωτεΐνης με τη διαβάθμιση της ευαισθησίας που φάνηκε από είδος σε είδος του γένους Aspergillus.
Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι φυσιολογικές συνθήκες, κάτω από τις οποίες εξελίσσονται οι δοκιμές αύξησης, δρουν καταλυτικά στην αποτελεσματικότητα του φαρμάκου έναντι του κυττάρου στόχου. Αρκεί να υπογραμμιστεί ο σημαντικός ρόλος της θερμοκρασίας στη ρευστότητα των μεμβρανών και κατά συνέπεια στη διάχυση των ουσιών, όπως επίσης και του pH στους μεταφορείς που λειτουργούν με συμεταφορά πρωτονίων. Οι δοκιμές σε διαφορετικές φυσιολογικές συνθήκες έδειξαν ότι, σε υψηλό pH η συσσώρευση του boscalid γίνεται με τη διαμεσολάβηση μεταφορέων, ενώ σε χαμηλότερο pH γίνεται τόσο με τη διαμεσολάβηση μεταφορέων όσο και με διάχυση. Τέλος, η διαθέσιμη πηγή αζώτου ρυθμίζει την έκφραση των μεταφορέων. Πιο αναλυτικά, η παρουσία αμμωνιακών ιόντων ως μοναδική πηγή αζώτου, καταστέλλει την έκφραση μεταφορέων που χρησιμεύουν στη μεταφορά εναλλακτικών πηγών αζώτου, όπως οι μεταφορείς πουρινών και πυριμιδινών οι οποίοι παρουσιάζουν χαμηλά επίπεδα έκφρασης. Στην περίπτωση όπου η μοναδική πηγή αζώτου ήταν τα αμμωνιακά ιόντα, παρατηρήθηκε ότι το boscalid ήταν αναποτελεσματικό έναντι του αγρίου τύπου στελέχους Aspergillus nidulans. Το γεγονός αυτό κατέδειξε ότι, οι μεταφορείς νουκλεοτιδικών βάσεων πιθανά να εμπλέκονται στη συσσώρευση του boscalid.
Η περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού δράσης του boscalid έγινε χρησιμοποιώντας στελέχη από την τράπεζα στελεχών του Εργαστηρίου Μοριακής Βιολογίας Μυκήτων, καθώς επίσης και νέα στελέχη που κατασκευάστηκαν κατά την πορεία της μελέτης με επιθυμητές ιδιότητες. Αναλυτικότερα, έγιναν δοκιμές αύξησης παρουσία του υπό εξέταση αντιμυκητιακού φαρμάκου, σε στελέχη με μεταλλαγές σε μεταγραφικούς παράγοντες. Στέλεχος areA30, με σημειακή μεταλλαγή (Leu683Met) στον μεταγραφικό παράγοντα area, εμφάνισε αυξημένη ανθεκτικότητα σε σχέση με το αγρίου τύπου στέλεχος. Παράλληλα, στέλεχος (Δ7) με διεγραμμένους 7 μεταφορείς (πουρινών, πυριμιδινών και αλλαντοΐνης), εμφάνισε αντίστοιχη ανθεκτικότητα. Οι μεταφορείς αυτοί ήταν οι UapA, UapC, AzgA, FcyB, FurD, CntA και FurA. Τέλος, για τη διερεύνηση του κατά πόσο εμπλέκονται και οι 7 αυτοί μεταφορείς στη συσσώρευση του boscalid εντός του κυττάρου του μύκητα, έγινε μετασχηματισμός σε ισογενετικό υπόβαθρο του στελέχους Δ7, με κάθε έναν από αυτούς τους 7 μεταφορείς υπό τον έλεγχο ισχυρού υποκινητή κάθε φορά, ώστε η αναστροφή του ανθεκτικού φαινοτύπου να αποκαλύψει την εμπλοκή ή όχι του καθενός από αυτούς στη συσσώρευση του φυτοφαρμάκου. Τα αποτελέσματα υπέδειξαν ότι, στη συσσώρευση του boscalid συμμετέχουν οι UapC, AzgA, FcyB,CntA και FurA. Αντίθετα, οι μεταφορείς UapA και FurD δεν εμπλέκονται στη διαδικασία συσσώρευσης του boscalid. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνονται από τα μέχρι τώρα βιβλιογραφικά δεδομένα για τον έλεγχο των παραπάνω επτά μεταφορέων από τον μεταγραφικό παράγονται Αrea, σε συνδυασμό με τα πειράματα μικροσκοπίας φθορισμού που έγιναν κατά την εκπόνηση της παρούσας μελέτης. Ύστερα από τη σήμανση των τριών βασικών μεταφορέων FurA, AzgA, UapC με πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη, παρατηρήθηκε ενδοκύττωση των μεταφορέων αυτών μετά από την επίδραση με boscalid, όπως και βιβλιογραφικά έχει επιβεβαιωθεί για τους μεταφορείς αυτούς ότι συμβαίνει παρουσία του υποστρώματός τους. Το γεγονός αυτό καταδεικνύει τη συσσώρευση και τη μεταφορά του φυτοφαρμάκου εντός του κυττάρου του μύκητα μέσω αυτών των μεταφορέων.
Κλείνοντας, πέρα από τη διερεύνηση συγκεκριμένων μεταφορέων στη συσσώρευση του boscalid, έγινε προσπάθεια ανεξάρτητης εύρεσης και νέων γονιδίων που πιθανά να σχετίζονται με την ανθεκτικότητα του μύκητα έναντι του boscalid με τη χρήση του μεταθετού στοιχείου Minos. Σε πρώτο επίπεδο έγινε βελτιστοποίηση της μεθόδου ανίχνευσης ένθεσης του μεταθετού στοιχείου Minos και στη συνέχεια απομονώθηκε στέλεχος με ένθεση του μεταθετού στοιχείου Minos στον υποκινητή του γονιδίου AN6927. Πιθανολογείται ότι, η πρωτεΐνη το γονίδιο AN6927 έχει ρόλο αισθητήρα τόσο για την αντίληψη της ωσμωτικής καταπόνησης, όσο και για τη μεταγωγή σήματος και ενεργοποίηση γονιδίων που σχετίζονται με την πρόσληψη του boscalid, γεγονός που χρήζει περαιτέρω διερεύνησης.
