Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Δημήτριος Λουτράδης, Καθηγητής, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Πέτρος Δρακάκης , Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Κωνσταντίνος Καλλιανίδης , Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Η ποικιλομορφία των υπογόνιμων ασθενών, αποκλείει τη δυνατότητα ενός ενιαίου τρόπου αντιμετώπισης. Στο μέλλον, η γενετική διάγνωση μπορεί να επιτρέψει την πρόβλεψη της απάντησης στην εξωγενή ελεγχόμενη ωοθηκική διέγερση αλλά και την πρόβλεψη της έκβασης της IVF με βάση το γονότυπο κάθε ασθενούς.
Τα τελευταία 5-10 χρόνια, αρκετή προσοχή έχει δοθεί στο γονίδιο FMR1 και την εμπλοκή του στην αναπαραγωγική ιατρική. Η παρούσα εργασία μελετά την πιθανή επίδραση του γονιδίου FMR1 στην έκβαση της IVF. Το γονίδιο FMR1 βρίσκεται στο μεγάλο βραχίονα του Χ χρωμοσώματος στη θέση Χq27.3. Ο φυσιολογικός καρυότυπος θήλεος είναι 46,ΧΧ άρα κάθε γυναίκα φέρει 2 αλληλόμορφα FMR1 που αποτελούν το γονότυπό της.
Το πιο ενδιαφέρον χαρακτηριστικό αυτού του γονιδίου βρίσκεται στο 5΄ μη μεταφραζόμενο άκρο του και είναι μια (CGG)n αριθμητικά πολυμορφική τρινουκλεοτιδική επανάληψη. Αυτή η επαναλαμβανόμενη αλληλουχία μπορεί να έχει θετική ή αρνητική επίδραση στη μετάφραση ενώ η βέλτιστη μετάφραση συμβαίνει όταν οι επαναλήψεις είναι 30. Ο Fu και συνεργ. το 1991 μελέτησαν το πρότυπο κατανομής των διαφόρων αλληλομόρφων σε φυσιολογικά άτομα και βρήκαν ότι το πιο συχνά εμφανιζόμενο αλληλόμορφο είναι αυτό με τις 29 επαναλήψεις ενώ στο φυσιολογικό ελληνικό πληθυσμό το πιο συχνά εμφανιζόμενο αλληλόμορφο φέρει 28 επαναλήψεις. Σε φυσιολογικά άτομα ο αριθμός των CGG επαναλήψεων κυμαίνεται από 5-45 οδηγώντας σε φυσιολογική μεταγραφή mRNA, μετάφραση και έκφραση. Το αλληλόμορφο προμετάλλαξης (55-200 επαναλήψεις) οδηγεί σε αυξημένη μεταγραφή mRNA αλλά μειωμένη έκφραση FMRP. Άρρενες φορείς αλληλομόρφου προμετάλλαξης έχουν αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης Σύνδρομο Τρόμου/Αταξίας ενώ θήλεις φορείς έχουν 20% κίνδυνο Πρόωρης Ωοθηκικής Ανεπάρκειας. Το αλληλόμορφο πλήρους μετάλλαξης (>200 επαναλήψεις) οδηγεί στην εμφάνιση Σύνδρομου Έυθραυστου Χ. Η παρούσα εργασία επικεντρώνει το ενδιαφέρον της στο φυσιολογικό εύρος επαναλήψεων.
Η FMRP δρα ως καταστολέας της κυτταρικής μετάφρασης. Ελέγχει το βαθμό μετάφρασης πολλών μεταγράφων (συμπεριλαμβανομένου και του δικού της). Στους ανθρώπους, η FMRP εκφράζεται μετά τη γέννηση στη θήλυ γαμετική σειρά, κυρίως στα κοκκώδη κύτταρα ενώ σε πειραματικό μοντέλο επίμυ έχει παρατηρηθεί αυξημένη έκφραση FMRP καθώς τα ωοθυλάκια αναπτύσονται. Γυναίκες με (CGG)n εκτός του εύρους που έχει συσχετισθεί με τη φυσιολογική ωοθυλακιογένεση (2634) αναμένεται να έχουν χαλαρό μεταγραφικό έλεγχο, τροποποιημένα επίπεδα FMRP τα οποία θα επηράσουν την ωοθυλακιογένεση.
Στην πρόσφατη βιβλιογραφία, 29-30 CGG επαναλήψεις έχουν προταθεί ως αντιπροσωπευτικές φυσιολογικής ωοθηκικής εφεδρείας ενώ υψηλότερος ή χαμηλότερος αριθμός υποδηλώνει κίνδυνο για Πρόωρη Ωοθηκική Γήρανση. Επιπλέον, προτάθηκαν νέοι γονότυποι, μέσα στο φυσιολογικό εύρος, σε σχέση με την δράση του FMR1 γονιδίου στη φυσιολογία της ωοθήκης: Φυσιολογικός γονότυπος, εάν και τα δύο αλληλομόρφα φέρουν από 26-34 επαναλήψεις CGG, ετερόζυγος γονότυπος αν το ένα αλληλόμορφο φέρει αριθμό επαναλήψεων εκτός 26-34 και ομόζυγος γονότυπος εάν και τα δύο αλληλόμορφα φέρουν αριθμό επαναλήψεων εκτός του παραπάνω εύρους. Οι FMR1 γονοτυποι έχουν συσχετισθεί με την πιθανότητα εγκυμοσύνης: ο ετερόζυγος κυρίως και με μειωμένη πιθανότητα σε σχέση με το φυσιολογικό γονότυπο. Επιπλέον, η παρουσία χαμηλού αλληλομόρφου (<26 CGG), έχει συσχετισθεί με σημαντικά χειρότερη ποιότητα εμβρύων και μικρότερη πιθανότητα εγκυμοσύνης.
Μελετήθηκαν 62 υπογόνιμες γυναίκες σε πρωτόκολλο εξωσωματικής γονιμοποίησης, 26 από αυτές ήταν πτωχές απαντήτριες (σύμφωνα με τα κριτήρια της Μπολόνια) και 36 καλές απαντήτριες εάν είχαν ≥8 ωάρια, βασική τιμή FSH≤10 mIU/mL και μέγιστη τιμή Ε2≥1500 pg/mL. Η αιτία υπογονιμότητας τους ήταν σαλπιγγική, ανδρική ή ανεξήγητη. Διαθέσιμα στοιχεία ήταν ηλικία, βάρος, ΒΜΙ, έτη υπογονιμότητας, προηγούμενοι κύκλοι IVF, ενδοκρινολογικό προφίλ (FSH,LH,PRL,TSH), παράμετροι της διέγερσης/πρόκλησης (ημέρες πρόκλησης, σύνολο χορηγούμενης δόσης FSH, μέγιστη τιμή Ε2) καθώς επίσης και η έκβαση της IVF( αριθμός ωοθυλακίων, αριθμός ωαρίων, δείκτης ωρίμανσης, δείκτης γονιμοποίησης, ποιότητα εμβρύων, εγκυμοσύνη). Το πειραματικό πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε περιελάμβανε τη συλλογή δειγμάτων και στοιχείων, την απομόνωση DNA, την ενίσχυση της επιθυμητής αλληλουχίας με PCR, την τριχοειδική ηλεκτροφόρηση, την ανάλυση με ειδικό λογισμικό και τέλος τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων.
Η καμπύλη κατανομής των συχνοτήτων των FMR1 αλληλομόρφων, με βάση τον αριθμό των CGG επαναλήψεων, για τον μελετηθέντα ελληνικό υπογόνιμο πληθυσμό βρέθηκε σε συμφωνία με την καμπύλη κατανομής του Fu. Δεν βρέθηκε μετατόπιση της καμπύλης κατανομής προς τα δεξιά (μεγαλύτερος αριθμός επαναλήψεων), ούτε στο σύνολο του δείγματος ούτε όταν μελετήθηκαν ξεχωριστά οι πτωχές και οι καλές απαντήτριες. Επιπλέον δεν βρέθηκαν ούτε ενδιάμεσα αλληλόμορφα ούτε αλληλόμορφα προμετάλλαξης. Το αλληλόμορφο με 28 επαναλήψεις CGG ήταν το πιο συχνά εμφανιζόμενο στο σύνολο του μελετηθέντος δείγματος αλλά και στις πτωχές και καλές απαντήτριες ξεχωριστά (43,5%, 42,3%, 44,4% αντίστοιχα) και αυτό δεν ήταν διαφορετικό από το παρατηρούμενο στο γενικό ελληνικό πληθυσμό. Ο πιο συχνά εμφανιζόμενος γονότυπος τόσο στις πτωχές όσο και στις καλές απαντήτριες ήταν ο φυσιολογικός (52,8% , 46,2% αντίστοιχα). Η κατανομή των γονοτύπων μεταξύ πτωχών και καλών απαντητριών δεν διέφερε σε στατιστικά σημαντικό επίπεδο (p-value 0,256). Με κριτήριο τον FMR1 γονότυπό τους: οι υπογόνιμες γυναίκες με φυσιολογικό γονότυπο είχαν λιγότερο αριθμό ημερών πρόκλησης, υψηλότερο βαθμό ωρίμανσης ωαρίων και παρουσίασαν τα καλύτερα ποσοστά εγκυμοσύνης. Οι υπογόνιμες γυναίκες με τον ομόζυγο γονότυπο χρειάστηκαν τις περισσότερες ημέρες πρόκλησης και είχαν το χαμηλότερο βαθμό ωρίμανσης ωαρίων. Τα συγκριτικά ποσοστά εγκυμοσύνης σε αυτή την υποεκπροσωπούμενη ομάδα παραμένουν για μας ασαφή. Οι υπογόνιμες γυναίκες με τον ετερόζυγο γονότυπο παρουσίασαν 83% μικρότερα ποσοστά εγκυμοσύνης σε σχέση με τις φυσιολογικές γυναίκες. Στο σύνολο του μελετηθέντος πληθυσμού, γυναίκες που δεν έφεραν χαμηλό αλληλόμορφο στο γονότυπό τους, είχαν λιγότερο αριθμό ημερών πρόκλησης σε σχέση με αυτές που έφεραν χαμηλό αλληλόμορφο (p-value = 0,033). Στο σύνολο του υπογόνιμου πληθυσμού, η παρουσία χαμηλού αλληλομόρφου (CGG<26) δεν συσχετίστηκε με διαφορές στην πιθανότητα εγκυμοσύνης (p-value=0,198).
Συμπερασματικά, οι γονότυποι του γονιδίου FMR1φαίνεται ότι έχουν τόσο ποσοτική (ημέρες πρόκλησης) όσο και ποσοτική (δείκτης ωρίμανσης) επίδραση στην έκβαση της IVF καθώς επίσης και στην πιθανότητα εγκυμοσύνης. Το γονίδιο FMR1 θα μπορούσε να θεωρηθεί ως ένα γονίδιο που εμπλέκεται στην επιτυχή έκβαση της IVF. Επιπλέον, η δημιουργία ενός πολυγονιδιακού εξατομικευμένου προφίλ, σε συνδυασμό με άλλα γονίδια που εμπλέκονται στη διαδικασία της IVF είναι μία ακόμα επιλογή όπου το FMR1 γονίδιο θα μπορούσε να αποδειχθεί πληροφοριακό.
Ο συγκριτικά μικρός αριθμός του μελετηθέντος δείγματος επιτρέπει μόνο την εξαγωγή πρώιμων συμπερασμάτων τα οποία χρειάζεται να επιβεβαιωθούν σε μεγαλύτερο αριθμό ατόμων. Η τυχαία απενεργοποίηση του Χ χρωμοσώματος θα μπορούσε να επηρεάζει την επίδραση των γονοτύπων του FMR1 στην ωοθήκη.
