Κατεύθυνση Μικροβιακή Βιοτεχνολογία
Βιβλιοθήκη Σχολής Θετικών Επιστημών

2018-05-01

2018

Χατζηκωτούλα Χρυσάνθη

Δημήτριος Χατζηνικολάου, Αναπληρωτής Καθηγητής Μικροβιακής Βιοτεχνολογίας, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Γεώργιος Διαλλινάς , Καθηγητής Μοριακής Μικροβιολογίας, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Κωνσταντίνος E. Βοργιάς, Καθηγητής Bιοχημείας, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ

Κλωνοποίηση, παραγωγή και βιοχημικός χαρακτηρισμός μιας GH48 κυτταρινάσης από το βακτηριακό στέλεχος Bacillus safensis

Ελληνικά

Κλωνοποίηση, παραγωγή και βιοχημικός χαρακτηρισμός μιας GH48 κυτταρινάσης από το βακτηριακό στέλεχος Bacillus safensis

Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε μία γλυκοζιδική υδρολάση της οικογένειας 48 (GH48), από το βακτηριακό στέλεχος Bacillus safensis. Πιο συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση, παραγωγή και βιοχημικός χαρακτηρισμός του υπό μελέτη ενζύμου.
Ο μικροοργανισμός απομονώθηκε από εδαφικό δείγμα το 1999 από τον Χριστακόπουλο και τους συνεργάτες του (Christakopoulos et al., 1999) και χαρακτηρίστηκε στην παρούσα εργασία ως B. safensis βάσει της πλήρους αλληλουχίας του 16S rRNA γονιδίου. Ακολούθησε εντοπισμός του γονιδίου της Cel48_B.s. κυτταρινάσης βάσει στοίχισης των αντίστοιχων γονιδίων των βακτηρίων B. safensis και B. pumilus. Το γονίδιο ενσωματώθηκε σε πλασμιδιακό φορέα pET-15b και εκφράστηκε σε τροποποιημένα βακτηριακά κύτταρα Escherichia coli BL21. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε καθαρισμός του ενζύμου με χρωματογραφία συγγενείας νικελίου, μετά από θραύση των κυττάρων με υπερήχους.
Ακολούθησε ο ενζυμικός χαρακτηρισμός της Cel48_B.s. κυτταρινάσης. Αρχικά, προσδιορίστηκε το μοριακό βάρος του ενζύμου με SDS - PAGE ηλεκτροφόρηση, 79 kDa, αλλά και η τεταρτοταγής δομή αυτού με χρωματογραφία μοριακής διήθησης. Η υδρολυτική ικανότητα της απομονωμένης Cel48_B.s. ελέγχθηκε σε διάφορα υποστρώματα. Η μέγιστη ενζυμική δράση παρατηρήθηκε παρουσία διογκωμένης κυτταρίνης (PASC), ενώ ανιχνεύθηκε επίσης έναντι της καρβοξυλ-μεθυλ-κυτταρίνης (CMC). Ακόμη, το ένζυμο παρουσίασε ενεργότητα έναντι κρυσταλλικής κυτταρίνης (avicel ) και διηθητικού χαρτιού (filter paper). Η μέγιστη ενζυμική δράση ανιχνεύθηκε σε θερμοκρασία 60 oC και σε pH 6. Η θερμοσταθερότητα του ενζύμου μελετήθηκε στις θερμοκρασίες 60 οC, 65 oC, 70 oC και 80 oC και φάνηκε πως αυτό είναι ιδιαίτερα θερμοσταθερό στους 60 oC και 65 oC. Όσον αφορά στα προϊόντα ενζυμικής υδρόλυσης, μετά από επώαση του ενζύμου σε διαφορετικά υποστρώματα, παρατηρήθηκε πως το μεγαλύτερο ποσοστών των προϊόντων είναι η κελλοβιόζη, ενώ δευτερευόντως υπάρχει παραγωγή γλυκόζης και ολιγοσακχαριτών. Τέλος, προσδιορίστηκαν οι κινητικές σταθερές Michaelis – Menten για τα υποστρώματα PASC και CMC.
Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε μία βιοπληροφορική μελέτη για το υπό μελέτη ένζυμο. Αρχικά, παρατηρήθηκε πως το γονίδιο που κωδικοποιεί την Cel48_B.s. ανήκει σε ένα γονιδιακό συνεργίωμα, το οποίο περιλαμβάνει γονίδια που κωδικοποιούν υδρολάσες που σχετίζονται με την αποικοδόμηση της (ημι)κυτταρίνης. Μελετήθηκε επίσης η πρωτεϊνική οργάνωση ενζύμων της οικογένειας GH48 σε σχέση με τις πρωτεϊνικές επικράτειες που φέρουν. Τέλος, κατασκευάστηκαν φυλογενετικά δέντρα τόσο βάσει της GH48 επικράτειας των ενζύμων αυτών, όσο και βάσει της πλήρους αμινοξικής αλληλουχίας της πρωτεΐνης, αλλά και του 16S rRNA γονιδίου των μικροοργανισμών που φέρουν τα συγκεκριμένα ένζυμα. Τα υψηλότερα ποσοστά ταυτότητας του υπό μελέτη ενζύμου φαίνεται πως εντοπίζονται με τα αντίστοιχα ένζυμα των βακτηρίων Paenibacillus barcinonensis και Myxobacter sp. AL-1, ενώ με το τελευταίο μοιράζονται και κοινή, μοναδική πρωτεϊνική οργάνωση.

Θετικές Επιστήμες

κυτταρίνη, κυτταρινάση, ένζυμο, Bacillus safensis, γλυκοζιδική υδρολάση GH48

Ναι

3

Όχι

79

72

Δεν επιτρέπεται η πρόσβαση στο αρχείο. H πρόσβαση επιτρέπεται μόνο εντός του δικτύου του ΕΚΠΑ.

https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/object/2750784