Πειραματική επιβεβαίωση της στόχευσης του mRNA της Καλλικρεΐνης 3 από microRNAs μόρια

Διπλωματική Εργασία uoadl:2768050 46 Αναγνώσεις

Μονάδα:
Κατεύθυνση Κλινική Βιοχημεία - Μοριακή Διαγνωστική
Βιβλιοθήκη Σχολής Θετικών Επιστημών
Ημερομηνία κατάθεσης:
2018-06-07
Έτος εκπόνησης:
2018
Συγγραφέας:
Δραγόλια Μελίνα
Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Σίδερης Διαμάντης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Πρωτότυπος Τίτλος:
Πειραματική επιβεβαίωση της στόχευσης του mRNA της Καλλικρεΐνης 3 από microRNAs μόρια
Γλώσσες εργασίας:
Ελληνικά
Μεταφρασμένος τίτλος:
Πειραματική επιβεβαίωση της στόχευσης του mRNA της Καλλικρεΐνης 3 από microRNAs μόρια
Περίληψη:
Τα γονίδια των ανθρώπινων ιστικών καλλικρεϊνών κωδικοποιούν για πρωτεάσες σερίνης και εντοπίζονται σε πολλούς ιστούς και βιολογικά υγρά. Ο γενετικός τους τόπος (19q13.4) αποτελείται από 15 μέλη, τα οποία χαρακτηρίζονται από σημαντική ομοιότητα στη δομή και τη λειτουργία τους. Η εμπλοκή τους σε παθολογικές καταστάσεις του ανθρώπινου οργανισμού, έχει στρέψει το ερευνητικό ενδιαφέρον στον εντοπισμό miRNA μορίων που λειτουργούν ως ρυθμιστές της έκφρασης των γονιδίων των καλλικρεϊνών.
Τα miRNAs ανήκουν στην κατηγορία των ρυθμιστικών μη κωδικών μορίων RNA και το μέγεθός τους είναι περίπου 19-24 νουκλεοτίδια. Ο ρόλος αυτών των μικρών μη κωδικών μορίων RNA σχετίζεται με τη μετα-μεταγραφική σίγηση διαφόρων γονιδίων, καθώς δρουν είτε αποικοδομώντας τα mRNA μετάγραφα είτε καταστέλλοντας την μετάφρασή τους. Συγκεκριμένα, η καταλυτική τους δράση πραγματοποιείται μέσω αλληλεπίδρασης με την 3’-UTR των διαφόρων μεταγράφων.
Η παρούσα εργασία είχε ως σκοπό την εύρεση υποψήφιων miRNA μορίων που επιδρούν στο γονίδιο της KLK3, καθώς υπάρχουν ελάχιστα βιβλιογραφικά δεδομένα που να υποδεικνύουν τη στόχευση του mRNA της KLK3 από τους συγκεκριμένους γονιδιακούς ρυθμιστές. Σε αυτό, βοήθησε το πεδίο της βιοπληροφορικής μέσω αναζήτησης σε κατάλληλους αλγόριθμους πρόβλεψης των miRNA στόχων. Το miR-936 ήταν αυτό που παρουσίαζε την υψηλότερη κατάταξη ως υποψήφιο μόριο που στοχεύει το γονίδιο KLK3. Ακολούθως, εφαρμόστηκε η πειραματική επιβεβαίωση αυτής της προβλεπόμενης αλληλεπίδρασης του miR-936 με την 3’-UTR του μεταγράφου της KLK3 με τη μέθοδο δοκιμής του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης. Η εργαστηριακή διαδικασία περιελάμβανε την κλωνοποίηση της 3’-UTR του KLK3 στον πλασμίδιο pMIR-REPORT™ Luciferase, που φέρει το γονίδιο που κωδικοποιεί για το ένζυμο της λουσιφεράσης, τον ποιοτικό και ποσοτικό έλεγχο της έκφρασης του πλασμιδίου του miR-936 στα HEK293T κύτταρα και τέλος, τη συνδιαμόλυνση των κυττάρων αυτών με τα πλασμίδια προς εξέταση της πιθανότητας αλληλεπίδρασης μεταξύ του miR-936 και του mRNA της KLK3 μέσω μέτρησης της ενζυμικής ενεργότητας της λουσιφεράσης. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε εργαστηριακή εκτέλεση μιας επιβεβαιωμένης μέλετης, όπου το miR-423-5p έχει αποδειχθεί ότι στοχεύει το γονίδιο OGT (Mus Musculus), προκειμένου να οριστούν οι κατάλληλες συνθήκες για την διεξαγωγή του τελικού πειραματικού σταδίου της παρούσας εργασίας. Το miR-423-5p διαθέτει τον ίδιο πλασμιδιακό φορέα με το miR-936 και χρησιμοποιήθηκε ως ο αρνητικός του μάρτυρας στα πειράματα συνδιαμόλυνσης.
Τα αποτελέσματα που προέκυψαν, μετά από εκτέλεση του τελικού σταδίου της παρούσας εργασίας, εφαρμόζοντας τις ίδιες πειραματικές συνθήκες με την επιβεβαιωμένη μελέτη, οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι το υποψήφιο miR-936 πιθανόν να μην επιδρά στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης της KLK3. Παρόλα αυτά, μια περαιτέρω ανάλυση θα μπορούσε να συμβάλλει στην εξαγωγή ακριβέστερων συμπερασμάτων.
Κύρια θεματική κατηγορία:
Θετικές Επιστήμες
Λέξεις-κλειδιά:
πειραματική επιβεβαίωση, στόχευση, mRNA Καλλικρεΐνης 3, microRNAs μόρια
Ευρετήριο:
Όχι
Αρ. σελίδων ευρετηρίου:
0
Εικονογραφημένη:
Ναι
Αρ. βιβλιογραφικών αναφορών:
88
Αριθμός σελίδων:
105

Πειραματική επιβεβαίωση της στόχευσης του mRNA της Καλλικρεινης 3 από microRNAs μόρια.pdf
2 MB
Δεν επιτρέπεται η πρόσβαση στο αρχείο έως 2019-06-13.