Setup and optimization of phosphoproteomic methodologies for the analysis of tissues from DUSP8 CRISPR-knockout mice

Διπλωματική Εργασία uoadl:2785146 53 Αναγνώσεις

Μονάδα:
Κατεύθυνση Μοριακή Βιοϊατρική - Μηχανισμοί Ασθενειών, Μοριακές και Κυτταρικές θεραπείες και Βιοκαινοτομία
Βιβλιοθήκη Επιστημών Υγείας
Ημερομηνία κατάθεσης:
2018-09-12
Έτος εκπόνησης:
2018
Συγγραφέας:
Ζωγραφάκης Αλέξανδρος
Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Παναγιώτου Γεώργιος, Ερευνητής Α', Τομέας Μοριακής Ογκολογίας, Ερευνητικό Κέντρο Βιοϊατρικών Επιστημών "Αλέξανδρος Φλέμινγκ"
Κωστούρου Βασιλική, Ερευνήτρια Β', Τομέας Ανοσολογίας, Ερευνητικό Κέντρο Βιοϊατρικών Επιστημών "Αλέξανδρος Φλέμινγκ"
Κουτσιλιέρης Μιχαήλ, Καθηγητής, Ιατρικής, ΕΚΠΑ
Πρωτότυπος Τίτλος:
Setup and optimization of phosphoproteomic methodologies for the analysis of tissues from DUSP8 CRISPR-knockout mice
Γλώσσες εργασίας:
Αγγλικά
Μεταφρασμένος τίτλος:
Ρύθμιση και βελτιστοποίηση μεθοδολογιών φωσφοπρωτεομικής για την ανάλυση ιστών από γενετικώς τροποποιημένα με τεχνολογία CRISPR ποντίκια με έλλειψη της πρωτεΐνης DUSP8
Περίληψη:
Το μονοπάτι των πρωτεϊνικών κινασών που ενεργοποιούνται από μιτογόνα (MAPKs) συμμετέχει σε πολλές διαφορετικές βιολογικές διεργασίες, όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η κυτταρική διαφοροποίηση, επιβίωση, απόπτωση και φλεγμονή. Σχετίζεται και με μια πληθώρα ασθενειών, όπως ο καρκίνος και o νευροεκφυλισμός. Αποτελείται από μία αλληλουχία αντιδράσεων φωσφορυλίωσης που χωρίζεται σε τρία επίπεδα και οδηγεί είτε στην ενεργοποίηση ενός πυρηνικού μεταγραφικού παράγοντα για τη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων είτε στην ενεργοποίηση κάποιας κυτταροπλασματικής πρωτεΐνης. Περιλαμβάνει τρεις μεγάλες υποοικογένειες: Τις ERK1/2 κινάσες, τις p38 κινάσες και τις c-Jun N-terminal κινάσες (JNK). Ακόμη κι αν κάθε επιμέρους μονοπάτι συμμετέχει γενικά σε διαφορετικές διεργασίες, υπάρχουν συχνά φαινόμενα όπου παρατηρείται συνενεργοποίηση και συρρύθμιση, ειδικά στην περίπτωση των JNK/p38 κινασών, που είναι γνωστές και σαν κινάσες που ενεργοποιούνται από το στρες (SAPKs). Η δράση των MAPKs ρυθμίζεται από μία συγκεκριμένη ομάδα φωσφατασών, τις φωσφατάσες των πρωτεϊνικών κινασών που ενεργοποιούνται από μιτογόνα (MKPs). Οι MKPs ανήκουν σε μία μεγαλύτερη ομάδα πρωτεϊνών, τις φωσφατάσες διπλής ειδικότητας (DUSPs). Η διατριβή αυτή επικεντρώνεται στην DUSP8, μια φωσφατάση ειδική για JNK/p38 κινάσες, και στην αναστολή της από το αρσενικό, έναν παράγοντα που προκαλεί οξειδωτικό στρες και ενισχύει το μονοπάτι των JNK κινασών. Το πρώτο μέρος της διατριβής αφορά τη βελτιστοποίηση ενός πρωτοκόλλου φωσφοπρωτεομικής, από το βήμα της κυτταρικής καλλιέργειας ως το βήμα της ανάλυσης δεδομένων. Η ανάλυση με western χρησιμοποιώντας συγκεκριμένα αντισώματα σε λύματα HEK293T κυττάρων που είχαν καλλιεργηθεί σε διαφορετικές περιόδους στρεσογόνας διέγερσης, παρείχαν πληροφορίες σχετικά με τις περιόδους διέγερσης με αρσενικό όπου παρατηρήθηκαν σαφείς επιδράσεις στα γενικά επίπεδα φωσφορυλίωσης. Το αρσενικό φάνηκε να διεγείρει αποτελεσματικά την αύξηση των γενικών επιπέδων φωσφορυλίωσης. Τα βήματα που επακολούθησαν ήταν ο προσδιορισμός των παραμέτρων του φασματογράφου μάζας (MS) και η επιλογή της μεθόδου προετοιμασίας δειγμάτων, η οποία μετά από εμπλουτισμό του δείγματος σε φωσφοπεπτίδια και nanoLC-MS/MS ανάλυση θα συνείσφερε στην ταυτοποίηση του μεγαλύτερου αριθμού πρωτεϊνών και
πεπτιδίων. Οι εξεταζόμενες μέθοδοι προετοιμασίας δειγμάτων ήταν οι εξής τρεις: Μέθοδος προετοιμασίας με τη χρήση φίλτρων (FASP), μέθοδος προετοιμασίας ενισχυμένη με στερεά φάση (SP3) και πέψη βασισμένη σε τριφθοροαιθανόλη (TFE). Οι πιο κατάλληλες περίοδοι, παράμετροι και μέθοδοι χρησιμοποιήθηκαν στο δεύτερο μέρος της διατριβής, το οποίο περιλάμβανε τη φωσφοπρωτεομική LC-MS/MS ανάλυση εμβρυικών ινοβλαστών ποντικών. Τα κύτταρα αυτά λήφθηκαν από DUSP8-KO ποντίκια που δημιουργήθηκαν με την τεχνολογία CRISPR και από ποντίκια αγρίου τύπου της ίδιας γέννας. Η φωσφορυλίωση των πεπτιδίων εντοπίστηκε σε μεγαλύτερα επίπεδα στην περίπτωση των ινοβλαστών από τα DUSP8-KO ποντίκια. Δεν εντοπίστηκαν σχεδόν καθόλου φωσφορυλιωμένα κατάλοιπα τυροσίνης, πιθανώς λόγω της παροδικής τους φύσεως. Επίσης, παρατηρήθηκε αυξημένη φωσφορυλίωση υποστρωμάτων της κινάσης ERK2 στους ινοβλάστες των DUSP8-KO ποντικών, γεγονός που υποδηλώνει την πιθανή ρύθμιση της ERK2 από την DUSP8. Στο τελευταίο μέρος έγινε συγκριτική ανάλυση του ολικού πρωτεόματος ιστών από DUSP8-KO ποντίκια και ποντίκια αγρίου τύπου της ίδιας γέννας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υπερενεργοποίηση του μονοπατιού των JNK κινασών, λόγω απώλειας της DUSP8 στην περιοχή του εγκεφάλου, πιθανώς οδηγεί σε μιτοχονδριακή απόπτωση και νευροεκφυλισμό. Επιπροσθέτως, η κυτταρική απόκριση στο οξειδωτικό στρες μέσω του μονοπατιού ERK1/2 στην περιοχή του εγκεφάλου των DUSP8-KO ποντικών καθοδηγείται κυρίως από την αυξημένη έκφραση της κινάσης B-Raf, μίας από τις πρωτεΐνες που ταυτοποιήθηκαν στη συγκριτική ανάλυση του ολικού πρωτεόματος.
Κύρια θεματική κατηγορία:
Επιστήμες Υγείας
Λέξεις-κλειδιά:
DUSP8, MKP, MAPK σηματοδότηση, Φωσφοπρωτεομική, Αρσενικό
Ευρετήριο:
Όχι
Αρ. σελίδων ευρετηρίου:
0
Εικονογραφημένη:
Ναι
Αρ. βιβλιογραφικών αναφορών:
150
Αριθμός σελίδων:
80
Zografakis - Thesis.pdf (2 MB) Άνοιγμα σε νέο παράθυρο