Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Κουτσιλιέρης Μιχαήλ, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Χαβάκη Σοφία, Επίκουρη Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Πατέρας Ιωάννης, Επίκουρος Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια μελέτης της επαγώγιμης έκφρασης του γονιδίου p21CIP1/WAF1 (p21 χάριν συντομίας) σε κύτταρα MDAH041 (ινοβλάστες από δέρμα ασθενούς με το σύνδρομο Li-Fraumeni) προς περαιτέρω διερεύνηση προηγούμενων παρατηρήσεων του εργαστήριού μας. Στη συγκεκριμένη κυτταρική σειρά το ένα αλληλόμορφο του γονιδίου TP53 λείπει τελείως ενώ το άλλο φέρει μια μετάλλαξη που τροποποιεί το πλαίσιο ανάγνωσης με αποτέλεσμα να προκύπτει μια κολοβωμένη μορφή της πρωτεΐνης p53 με τελείως διαφορετική στερεοδιάταξη. Το επαγώγιμο κυτταρικό σύστημα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το Li-Fraumeni-TetON p21 στο οποίο η μεταγραφή ενεργοποιείται αντιστρεπτά παρουσία του αντιβιοτικού δοξυκυκλίνη (doxycycline).
Ο αναστολέας των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών CDK1 και CDK2, p21 εκδηλώνει αντι-πολλαπλασιαστικές δραστηριότητες μέσω p53-εξαρτώμενης και p53-ανεξάρτητης οδού. Ωστόσο, η πρωτεΐνη p21 μπορεί επίσης να προωθήσει την ογκογένεση. Σε όγκους με μεταλλαγμένο pRb/p53 παρατηρήθηκε ένας αριθμός από μεγάλα καρκινικά κύτταρα που παραδόξως παρουσίαζαν κοινή έκφραση (συνεντόπιση) του p21 και του μιτωτικού δείκτη Ki67. Έγινε η υπόθεση ότι η παρατεταμένη έκφραση του p21 οδήγησε σε μια επιλεκτική διαδικασία που επιτρέπει στα κύτταρα αυτά να ανακτήσουν την ικανότητα πολλαπλασιασμού τους. Αυτό το βιολογικό παράδοξο μεταφέρθηκε αρχικά για μελέτη στο κυτταρικό σύστημα Saos2-TetON p21 και στη συνέχεια στο σύστημα Li-Fraumeni-TetON p21. Κατά την έκφραση του p21, τα κύτταρα απέκτησαν ένα φαινότυπο γήρανσης που κορυφώθηκε κατά τη 10η ημέρα στα Saos2 και την 6η ημέρα στα MDAH041 (σύνδρομο Li-Fraumeni). Περαιτέρω παρατεταμένη έκφραση και στις δύο κυτταρικές σειρές οδήγησε στην ανάδυση ενός υπο-πληθυσμού πολλαπλασιαζόμενων p21 θετικών κυττάρων (κύτταρα “escaped”) με πιο επιθετικό φαινότυπο από ότι προηγουμένως (Galanos, Vougas et al. 2016). Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η υπερμικροσκοπική μελέτη των Li-Fraumeni σε τρία διαφορετικά χρονικά διαστήματα επαγώγιμης έκφρασης του p21 (0, 6 και 12 ημερών) καθώς η τελευταία οδηγεί τα κύτταρα αυτά σε φάση γήρανσης κατά την 6η μέρα και σε διαφυγή από αυτήν κατά τη 12η μέρα σύμφωνα με τους Galanos et al 2016. Για την υλοποίηση αυτού του σκοπού χρησιμοποιήθηκαν οι τεχνικές της κυτταροκαλλιέργειας και της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας.
Αρχικά πιστοποιήθηκε η έκφραση της πρωτεΐνης p21 κατόπιν επαγωγής με το αντιβιοτικό δοξυκυκλίνη, στον επιλεγμένο κλώνο των κυττάρων Li-Fraumeni που χρησιμοποιήθηκε για τα πειράματα της οπτικής και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας. Η επιβεβαίωση πραγματοποιήθηκε με την τεχνική του ανοσοφθορισμού στην οποία ως control χρησιμοποιήθηκαν τα MDAH041 χωρίς την προθήκη της δοξυκυκλίνης (Li-Fraumeni OFF) και συγκρίθηκαν ως προς εκείνα ύστερα από την έναρξη της επαγωγής διάρκειας 6 και 12 ημερών (Li-Fraumeni ON 6days και ON 12days αντίστοιχα). Όντως διαπιστώθηκε αυξημένη έκφραση της p21 τόσο στα κύτταρα με επαγωγή έκφρασης του γονιδίου για 6 ημέρες όσο και στα κύτταρα με διάρκεια μεταγραφικής ενεργοποίησης του για 12 ημέρες (κύτταρα “escaped”) σε σχέση με τα Li-Fraumeni OFF όπου δεν υπήρξε καθόλου έκφραση (Ενότητα 3.1).
Μετά από μια αρχική παρατήρηση των κυττάρων στις τρεις διαφορετικές βιολογικές καταστάσεις σε ανάστροφο μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης διαπιστώθηκε μια αλλαγή στη μορφολογία των κυττάρων Li-Fraumeni ON 6days, τα οποία φαίνεται να είναι μεγαλύτερα σε μέγεθος, να έχουν μεγαλύτερη αναλογία κυτταροπλάσματος και πυρήνα, με ευδιάκριτους πυρήνες και πυρηνίσκους και να έχουν ένα αρκετά κοκκιώδες κυτταρόπλασμα σε σχέση με τα κύτταρα OFF τα οποία παρουσιάζονται να είναι πιο ατρακτοειδή και επιμήκη, μερικά με πιο πεπλατυσμένο σχήμα, να έχουν λιγότερο ευδιάκριτους πυρήνες και πυρηνίσκους και να είναι πιο μικρά σε μέγεθος (Ενότητα 3.2). Στην πλειοψηφία των κυττάρων Li-Fraumeni ON 6days ταυτοποιήθηκε γηρασμένος φαινότυπος με την ανίχνευση σωματιδίων λιποφουσκίνης στο κυτταρόπλασμα μέσω της ανοσοϊστοχημικής χρώσης GL13 (SenTraGor) ενώ παρόμοια εικόνα δεν παρατηρήθηκε στα κύτταρα OFF (Ενότητα 3.3 ). Αξίζει να σημειωθεί ότι η πρόκληση της γήρανσης οφείλεται αποκλειστικά στην υπέρ-έκφραση του p21 και είναι ανεξάρτητη από την παρουσία του p53 το οποίο είναι μεταλλαγμένο και δεν ήταν δυνατόν να ανιχνευθεί τόσο με στύπωμα κατά Western όσο και με ανοσοφθορισμό στα μελετώμενα κύτταρα (Galanos, Vougas et al. 2016). Κατόπιν χορήγησης δοξυκυκλίνης για 12 μέρες η πλειοψηφία των κυττάρων “escaped” παρουσιάζονται μικρά σε μέγεθος και ατρακτοειδή, με ένα πιο ευμεγέθη κυτταρικό σώμα, ευδιάκριτους πυρήνες και πολυάριθμους πυρηνίσκους (Ενότητα 3.2). Τα γηρασμένα κύτταρα είναι πολύ λιγότερα κατά τη 12η μέρα υπερέκφρασης του p21 σε σχέση με την 6η ημέρα όπου κυριαρχεί ο γηρασμένος φαινότυπος. Επίσης συνήθης εικόνα στο ανάστροφο μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης μετά από 12 μέρες επαγώγιμης έκφρασης του p21 είναι ότι γύρω από γηρασμένα κύτταρα αναπτύσσονται άλλα με εντελώς διαφορετική μορφολογία τα οποία εκφράζουν το p21, επικοινωνούν μέσω αποφυάδων με τα γειτονικά γηρασμένα και έχουν τα μορφολογικά χαρακτηριστικά που περιγράφηκαν πιο πάνω (Κεφάλαιο 3.2).
Η υπερμικροσκοπική μελέτη των κυττάρων Li-Fraumeni σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης κατέδειξε τα εξής: Τα κύτταρα OFF είναι κυρίως ατρακτοειδούς μορφολογίας, φέρουν αρκετά κυστίδια στο κυτταρόπλασμά τους ενώ φαίνεται κάποια από αυτά να τα ενδοκυτταρώνουν μέσω λεπτών κυτταροπλασματικών προσεκβολών. Επιπλέον, στα πλαίσια της επικοινωνίας, τα κύτταρα αυτά εμφανίζουν σφαιρικές προσεκβολές του κυτταροπλάσματος οι οποίες εγκλείουν μικροκυστίδια και κάποιες από αυτές απελευθερώνονται στο διακυτταρικό χώρο, προοριζόμενες πιθανώς για γειτονικά κύτταρα. Περισσότερο σπάνια είναι η ύπαρξη αυτοφαγοσωμάτων ενώ ιδιαίτερα ενδιαφέρον εύρημα αποτελεί η καθολική παρουσία ελαττωματικής μορφολογίας μιτοχονδρίων. Συγκεκριμένα, τα μιτοχόνδρια εμφανίζονται επιμήκη με ανώμαλη διάταξη των ακρολοφιών τους (Ενότητα 3.4).
Από την άλλη πλευρά στα Li-Fraumeni ON 6days κυριαρχούν οι μεγάλοι και πολυλοβωτοί πυρήνες, το εκτεταμένο-διεσταλμένο ενδοπλασματικό δίκτυο ενώ περισσότερα είναι τα μιτοχόνδρια που έχουν απολέσει τις ακρολοφίες τους και είναι περισσότερο διογκωμένα και αποστρογγυλεμένα σε σχέση με εκείνα των κυττάρων OFF. H αυτοφαγία είναι επίσης ιδιαίτερα έντονη καθώς παρατηρούνται σε πολλά κύτταρα αυτοφαγοσώματα ποικίλων σταδίων διαμόρφωσης ενώ η παρουσία της ενισχύεται και από τον αυξημένο αριθμό λυσοσωμάτων στο κυτταρόπλασμα. Ο εκκριτικός φαινότυπος σχετιζόμενος με τη γήρανση (SASP) είναι ένα ακόμη εμφανές χαρακτηριστικό των κυττάρων αυτών τα οποία επικοινωνούν μεταξύ τους είτε μέσω λεπτών κυτταροπλασματικών προσεκβολών είτε μέσω διακυτταρικών γεφυρών στο σχηματισμό των οποίων πιθανόν μετέχουν μικροσωληνίσκοι (Ενότητα 3.4).
Τα κύτταρα “escaped” είναι πιο αποστρογγυλεμένα σε σχέση με τα ON 6days και χαρακτηρίζονται από πολυλοβωτούς πυρήνες με πολυάριθμους πυρηνίσκους. Παρατηρούνται λιγότερα αυτοφαγοσώματα σε σχέση με τα κύτταρα σε κατάσταση γήρανσης υποδεικνύοντας μειωμένη αυτοφαγική δραστηριότητα. Τα μιτοχόνδριά τους είναι σφαιρικά στην πλειοψηφία τους, διογκωμένα με αποδιαταγμένες ή και εντελώς απούσες τις ακρολοφίες τους. Παρατηρείται το φαινόμενο συσσώρευσής τους στην περιφέρεια των κυττάρων και η εγκόλπωση τους σε κυτταροπλασματικές προσεκβολές οι οποίες φαίνεται να αποκόβονται από το κυτταρικό σώμα (mitoptotic bodies). Η διαδικασία αυτή ονομάζεται μιτόπτωση και αφορά την απαλλαγή των κυττάρων από τα μη φυσιολογικής μορφολογίας και λειτουργίας μιτοχόνδρια μέσω ενός προγραμματισμένου μιτοχονδριακού θανάτου (Tinari, Garofalo et al. 2007, Mijaljica, Prescott et al. 2010, Jangamreddy and Los 2012). Τέλος, πιθανόν να λαμβάνει χώρα στα συγκεκριμένα κύτταρα και η διαδικασία σύντηξης των μιτοχονδρίων (fusion) με σκοπό ίσως τον περιορισμό της αυτοφαγίας-μιτοφαγίας, την επαναφορά της αναπνευστικής δεινότητας των μιτοχονδρίων και τη διατήρηση της ομοιογένειας του γενετικού τους υλικού (Pernas and Scorrano 2016, Bordi, Nazio et al. 2017). Αυτά συνηγορούν επομένως στην επιβίωση ακολούθως της διαφυγής από τη γήρανση και της απόκτησης καρκινικών ιδιοτήτων από το συγκεκριμένο αναδυόμενο κυτταρικό υποπληθυσμό (Galanos, Vougas et al. 2016).
Λέξεις-κλειδιά:
Καρκίνος, Σύνδρομο Li-Fraumeni, p21, Γήρανση, Κυτταρική Επικοινωνία, Αυτοφαγία, Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Διέλευσης
