Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Λουτράδης Δημήτριος, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Δρακάκης Πέτρος, Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Ντόμαλη Αικατερίνη, Επίκουρη Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Πρωτότυπος Τίτλος:
Μελέτη έκφρασης των υποδοχέων της CRH, CRH-R1 και CRH-R2 σε έμβρυα ποντικιού στα στάδια δύο, τεσσάρων και οκτώ κυττάρων και βλαστοκύστης
Μεταφρασμένος τίτλος:
Μελέτη έκφρασης των υποδοχέων της CRH, CRH-R1 και CRH-R2 σε έμβρυα ποντικιού στα στάδια δύο, τεσσάρων και οκτώ κυττάρων και βλαστοκύστης
Περίληψη:
Η CRH (Corticotropin-realising hormone, κορτικοεκλυτίνη), είναι ένα νευροπεπτίδιο 41 αμινοξέων, που συντίθεται στον υποθάλαμο και ρυθμίζει τον άξονα υποθαλάμου-υπόφυσης-επινεφριδίων. Οι βιολογικές λειτουργίες της CRH επιτυγχάνονται μέσω των μεμβρανικών υποδοχέων της, του CRH-R1 (α, β, γ, c-h) και του CRH-R2 (α, β, γ). Οι CRH υποδοχείς ενεργοποιούνται επίσης και από άλλους ενδογενείς αγωνιστές, όπως η ουροκορτίνη (UCN). Η CRH είναι ένας πολύ σημαντικός ρυθμιστής του στρες στα θηλαστικά. Αν και αρχικά έχει αναφερθεί ότι εκφράζεται στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα, όπου και αναστέλλει την φλεγμονώδη αντίδραση, αρκετές μελέτες δείχνουν ότι ο CRH εκφράζεται εξίσου σε αρκετούς περιφερικούς ιστούς ρυθμίζοντας την επίδραση στο στρες και επάγοντας τοπικά φλεγμονή. Ο CRH συμμετέχει στην ανθρώπινη φυσιολογία, από την στιγμή που η παθογένεση θεωρείται διαταραχή της ομοιόστασης, άρα και συνθήκη στρες.
Η CRH και οι υποδοχείς της εκφράζονται σε διάφορες θέσεις του γυναικείου αναπαραγωγικού συστήματος συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών, των ενδομητρικών αδένων, του φθαρτοποιημένου στρώματος, της τροφοβλάστης, της συγκυτιοτροφοβλάστης και του πλακούντα. Η CRH εκκρίνεται σε περιοχές φλεγμονής δρώντας ως προφλεγμονώδης παράγοντας. Η αναπαραγωγική CRH έχει αποδειχθεί ότι δρα ως αυτοκρινής και παρακρινής ρυθμιστής και συμμετέχει στην ωοθυλακιορρηξία, στη φθαρτοποίηση, στην εμφύτευση του εμβρύου και στη διατήρηση της κύησης. Η CRH που παράγεται από το φθαρτό και την τροφοβλάστη προάγει την έκκριση της FasL (προ-αποπτωτική κυτοκίνη). Κατά τη διάρκεια της εμφύτευσης της βλαστοκύστης, το ενδομήτριο έχει χαρακτηριστικά φλεγμονώδους απόκρισης, ωστόσο το έμβρυο δεν απορρίπτεται ως ημι-αλλομόσχευμα. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας ο ρόλος του μονοπατιού Fas/FasL είναι καθοριστικής σημασίας. Λόγω του μονοπατιού Fas/FasL η περίσσεια των Τ λεμφοκυττάρων απομακρύνεται μέσω μιας φλεγμονώδους αντίδρασης, οδηγώντας στην ανοσολογική ανοχή του εμβρύου.
Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν τους υποδοχείς CRH-R1 και CRH-R2, στα προεμφυτευτικά αναπτυξιακά στάδια των 2-, 4- και 8 κυττάρων και της βλαστοκύστης, εμβρύων ποντικιών. Για τη συλλογή των εμβρύων, θηλυκά ποντίκια αφέθηκαν να ζευγαρώσουν με αρσενικά ίδιας ηλικίας και στελέχους κατά τη διάρκεια της νύχτας. Στη συνέχεια τα θηλυκά θυσιάστηκαν, οι ωαγωγοί τους αφαιρέθηκαν και οι ζυγώτες συλλέχθησαν και καλλιεργήθηκαν. Έμβρυα στο στάδιο των 2-, 4- και 8-κυττάρων και βλαστοκύστεις συλλέχθηκαν έπειτα από συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα. Στη συνέχεια, το ολικό RNA εξήχθη από τα έμβρυα και με την τεχνική της αντίστροφης μεταγραφής κατασκευάστηκε η cDNA βιβλιοθήκη. Ακολούθησε η εφαρμογή της μεθόδου Real-Time PCR για τη μελέτη της έκφρασης. Τα ενισχυμένα προϊόντα υποβλήθηκαν κατόπιν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 3% που περιείχε βρωμιούχο αιθίδιο.
Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μελέτης, μόνο ο υποδοχέας CRH-R1 εκφράζεται σε σημαντικό βαθμό στα στάδια των 4 και 8 κυττάρων και στις βλαστοκύστεις. Η ανίχνευση του CRH-R1 στις βλαστοκύστες συνάδει με τα ευρήματα προηγούμενων μελετών. Ωστόσο, η ανίχνευση του CRH-R1 στα 2 πρωιμότερα στάδια, είναι ένα νέο έυρημα το οποίο επιβεβαιώνεται μόνο από μία προηγούμενη μελέτη, στην οποία χρησιμοποιήθηκε διαφορετική τεχνική. Συνεπώς, απαιτούνται περαιτέρων μελέτες για να επιβεβαιωθεί η παρουσία του υποδοχέα 1 σε αυτά τα πρωίμα στάδια. Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν ότι η CRH διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εμφύτευση των βλαστοκύστεων και μπορεί να επηρεάζει και πρωιμότερα αναπτυξιακά στάδια. Επομένως, η κατανόηση των μηχανισμών με τους οποίους η CRH επηρεάζει την εξέλιξη της προεμφυτευτικής ανάπτυξης, μπορεί δυνητικά να οδηγήσει σε τρόπους αντιμετώπισης του στρες ως παράγοντα υπογονιμότητας.
Λέξεις-κλειδιά:
Υποδοχέας CRH-R1, Υποδοχέας CRH-R2, Προεμφυτευτικά στάδια, Βλαστοκύστη, Έμβρυα ποντικιού
