Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Καθηγητής Ιωάννης Π. Τρουγκάκος, Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Επίκουρη Καθηγήτρια Βασιλική A. Οικονομίδου, Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Επίκουρος Καθηγητής Χρήστος Κοντός, Τομέας Βιοχημείας & Μοριακής Βιολογίας, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Σκοπός: Οι μυελικές νεοπλασίες είναι κλωνικές διαταραχές του αρχέγονου αιμοποιητικού κυττάρου (ΑΑΚ) και χαρακτηρίζονται από άσκοπο και άμετρο πολλαπλασιασμό ή/και διαταραχή της ωρίμανσης. Οι διαταραχές αυτές χωρίζονται σε δύο μεγάλες ομάδες νοσημάτων, στην Οξεία Μυελογενή Λευχαιμία (ΟΜΛ) και στα Χρόνια Μυελικά Νεοπλάσματα. Η ταξινόμηση αυτή βασίζεται κυρίως στον αριθμό των βλαστών στο περιφερικό αίμα ή τον μυελό των οστών. Με τη σειρά τους, τα Χρόνια Μυελικά Νεοπλάσματα ταξινομούνται σε τρείς κύριες κατηγορίες, τις Μυελοϋπερπλαστικές Νεοπλασίες (ΜΥΝ), τα Μυελοδυσπλαστικά Σύνδρομα (ΜΔΣ) και τα νοσήματα εκείνα που παρουσιάζουν χαρακτηριστικά και των δύο προηγούμενων κατηγοριών (ΜΔΣ/ΜΥΝ) σύμφωνα με κλινικά, μορφολογικά, γενετικά και μοριακά δεδομένα, όπως καταγράφονται στην πρόσφατη αναθεώρηση των διαγνωστικών κριτηρίων που εκδόθηκε πρόσφατα, από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (Π.Ο.Υ., 2016).
Μέχρι πρόσφατα, η διάγνωση και ταξινόμηση αυτών των νοσημάτων, βασιζόταν σχεδόν αποκλειστικά σε κυτταρολογικά χαρακτηριστικά και καρυοτυπικές αναλύσεις, με εξαίρεση πολύ συγκεκριμένες μοριακές βλάβες, όπως εκείνες στα γονίδια JAK2, CALR και MPL, που ανιχνεύονται στην πλειοψηφία των ασθενών με ΜΥΝ, σπανιότερα δε στα ΜΔΣ/ΜΥΝ. Η πρόοδος της τεχνολογίας οδήγησε σε καλύτερο χαρακτηρισμό της παθογένειας των μυελικών νεοπλασιών, με την ανάδειξη πληθώρας μεταλλάξεων σε γονίδια με ετερογενείς κυτταρικές λειτουργίες και μάλιστα με διαφορετική συχνότητα σε κάθε περίπτωση. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελούν οι συχνές μεταλλάξεις στα γονίδια JAK2, MPL και CALR, που ανιχνεύονται στην πλειοψηφία των ασθενών με Ιδιοπαθή Θρομβοκυτταραιμία (ΙΘ) ή Μυελοΐνωση (ΜΙ), και οι οποίες θεωρούνται φαινοτυπικές (phenotypic drivers) μεταλλάξεις.
Επιπλέον, μεταλλάξεις έχουν αναφερθεί σε γονίδια που εμπλέκονται στη ρύθμιση του επιγενετικού μηχανισμού ρύθμισης του κυττάρου, στον κυτταρικό κύκλο, στην ωρίμανση του mRNA και σε άλλες σημαντικές διεργασίες. Οι μεταλλάξεις αυτές θεωρείται πως διαμορφώνουν τον κλινικό φαινότυπο και συμβάλλουν στην πρόοδο και εξέλιξη της νόσου.
Σκοπό της παρούσας Διπλωματικής Εργασίας, αποτέλεσε η μελέτη του Μοριακού τοπίου των ασθενών με μυελικές νεοπλασίες, μέσω στοχευμένου προσδιορισμού της νουκλεοτιδικής ακολουθίας, συχνά μεταλλαγμένων γονιδίων, με χρήση τεχνολογίας δεύτερης γενιάς (targeted panel Next Generation Sequencing) και η ανάπτυξη μίας συμβατής βιοπληροφορικής ροής, για την ανάλυση των δεδομένων.
Η διαδικασία αυτή συνεισφέρει στην εύκολη, γρήγορη και αξιόπιστη Μοριακή τυποποίηση των ασθενών με μυελικές νεοπλασίες, συμβάλλοντας έτσι στην ορθή διάγνωση και ταξινόμηση, αλλά και σε πρόγνωση και διαστρωμάτωση του κινδύνου εκτροπής αυτών προς ΟΜΛ, ενώ ιδανικά, δύναται να παρέχει πληροφορίες σχετικά με τις διαθέσιμες θεραπευτικές επιλογές.
Μέθοδοι: Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε μία βιοπληροφορική ροή για την ανάλυση δεδομένων NGS, με στόχο την ανάδειξη μοριακών εξαλλαγών. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η προγραμματιστική γλώσσα Common Workflow Language (CWL) σε συνδυασμό με το λογισμικό Docker, που διευκολύνει τη χρήση, μεταφορά και επαναληψιμότητα της αναλυτικής διαδικασίας.
Συνολικά, μελετήθηκαν 51 ασθενείς με μυελικές νεοπλασίες σε Χρόνια ή Οξεία φάση. Αρχικά, απομονώθηκε DNA από περιφερικό αίμα ή μυελό των οστών. Ακολούθησε κατασκευή βιβλιοθηκών DNA, ενώ τέλος πραγματοποιήθηκε στοχευμένος προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής ακολουθίας 28 γονίδιων ή μεμονωμένων περιοχών αυτών. Οι περιοχές των γονιδίων που μελετήθηκαν αναφέρονται συχνά μεταλλαγμένα στους ασθενείς με μυελικές νεοπλασίες, όπως υποστηρίζεται από τη σύγχρονη βιβλιογραφία.
Αποτελέσματα: Συνολικά αναδείχθηκαν 223 μοριακές εξαλλαγές, εκ των οποίων 29 είχαν ήδη ανιχνευθεί προηγουμένως στο εργαστήριο μας, με ήδη εγκαθιδρυμένες τεχνικές Μοριακής Βιολογίας (post Real-time PCR HRMA και Sanger Sequencing). Από αυτές, 21 μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σε 9 ασθενείς με ΜΔΣ, 3 στον μοναδικό ασθενή με ΜΔΣ/ΜΥΝ, 173 σε 33 ασθενείς με ΜΥΝ και 26 στους 8 ασθενείς με ΟΜΛ.
Συμπεράσματα: Με την παρούσα εργασία αναδείξαμε τη μεγάλη ετερογένεια του μοριακού τοπίου των μυελικών νεοπλασιών, ακόμα και σε ίδιες ή παρόμοιες κοορτές ασθενών. Παράλληλα εγκαθιδρύσαμε την τεχνική NGS, για την ταυτόχρονη μελέτη πολλών γενομικών περιοχών, ολόκληρων εξωνίων ή και γονιδίων, για περισσότερους από έναν ασθενείς, σε μία μόνο αντίδραση και μάλιστα με υψηλή ευαισθησία.
Ταυτόχρονα, προτείνουμε βελτιώσεις, τόσο στο τεχνικό όσο και στο αναλυτικό υπόβαθρο της διαδικασίας, αποσκοπώντας σε βελτίωση της ευαισθησίας και ακρίβειας της μεθοδολογίας, κατά την ανάδειξη μοριακών εξαλλαγών, όπως επίσης σε εμπεριστατωμένη αξιολόγηση της επίπτωσης αυτών στο φαινότυπο της νόσου, με απώτερο στόχο την ενσωμάτωση της τεχνολογίας NGS στην κλινική πράξη.
