Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Ευθυμιόπουλος Σπύρος, Καθηγητής Φυσιολογίας Ζώων και Ανθρώπου – Νευροβιολογίας, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Τσιτσιλώνη Ουρανία, Καθηγήτρια Ανοσολογίας, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Παπαζαφείρη Παναγιώτα, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Φυσιολογίας Ζώων, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Ως άμεσος επαναπρογραμματισμός (direct reprogramming) ορίζεται η διαδικασία επαγόμενης δια-διαφοροποίησης πλήρως διαφοροποιημένων σωματικών κυττάρων σε άλλο κυτταρικό τύπο, παρακάμπτοντας την ενδιάμεση πολυδύναμη κατάσταση. Όσον αφορά τον άμεσο επαναπρογραμματισμό προς νευρώνες, αυτοί οι επαγόμενοι νευρώνες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την in vitro μελέτη νευροεκφυλιστικών ασθενειών καθώς και για την ανακάλυψη νέων προγνωστικών και διαγνωστικών δεικτών, καθώς και φαρμάκων. Επιπλέον, η αντικατάσταση χαμένων νευρώνων μετά από τραύμα, νευροεκφυλισμό ή εγκεφαλικό επεισόδιο μετά από άμεσο επαναπρογραμματισμό κυττάρων γλοίας προς επαγόμενους νευρώνες αποτελεί μία πολλά υποσχόμενη κυτταρική θεραπευτική προσέγγιση σε in vivo επίπεδο. Για τους παραπάνω σκοπούς έχουν γίνει μελέτες για τον άμεσο επαναπρογραμματισμό αστροκυττάρων προς επαγόμενους νευρώνες με χρήση συνδυασμών μεταγραφικών παραγόντων, micro-RNAs και μικρών χημικών μορίων. Η επίδρασή των παραπάνω μορίων πραγματοποιείται τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε επιγενετικό επίπεδο στο κύτταρο. Στις μελέτες, οι οποίες διεξάγονται, παρατηρείται οι ικανότητα των επαγόμενων κυττάρων προς το σχηματισμό συγκεκριμένων νευρωνικών υποτύπων και οι επαγόμενοι νευρώνες είναι λειτουργικοί και σε in vivo επίπεδο. Οι μηχανισμοί, οι οποίοι διέπουν τη διαδικασία του επαναπρογραμματισμού, ωστόσο, δε μας είναι ακόμη γνωστοί. Στην ομάδα μας αρχικά, εξετάσαμε τον ρόλο ενός σημαντικού κατά τη διαδικασία της νευρογένεσης micro-RNA, του miR-124 και ενός μικρού νευρογενετικού μορίου, του ISX9, ως προς τη δυνατότητά τους να επαναπρογραμματίζουν άμεσα αστροκύτταρα του εγκεφαλικού φλοιού ποντικού, μελετώντας παράλληλα τα μεταγραφικά δίκτυα, τα οποία διέπουν τη συγκεκριμένη διαδικασία. Ο μοριακός χαρακτηρισμός των επαγόμενων νευρώνων με RNA-sequencing αποκάλυψε πως οι μεταγραφικοί παράγοντες, οι οποίοι ρυθμίζονται σε αρχικό στάδιο κατά τη διαδικασία του επαναπρογραμματισμού, όπως οι Neurogenin2, NeuroD1, Tbr2 και Gsx2, συσχετίζονται άμεσα με την ανάπτυξη του πρόσθιου εγκεφάλου. Παρολ’ αυτά, μετά την προσθήκη του ISX9 παρατηρήθηκε η αύξηση των επιπέδων γονιδίων, όπως τα Lmx1b, En1, Foxa1, Girk2 και DAT, τα οποία σχετίζονται με την ανάπτυξη του μεσεγκέφαλου και των ντοπαμινεργικών νευρώνων, κάτι το οποίο υποδεικνύει την ικανότητα επαναπρογραμματισμού προς νευρωνικούς υπότυπους άλλων περιοχών του εγκεφάλου, πέραν του πρόσθιου. Επιπλέον, στη συγκεκριμένη ανάλυση παρατηρήθηκε επίσης, η μείωση των επιπέδων τόσο του Shh όσο και του βασικού μεταγραφικού παράγοντα-τελεστή του μονοπατιού του, Gli1, έπειτα από επαναπρογραμματισμό των κυττάρων μόνο με το miR-124 με επακόλουθη αύξηση των επιπέδων τους έπειτα από προσθήκη τους ISX9. Τα παραπάνω δεδομένα είχαν ως αποτέλεσμα τη σκέψη πως θα μπορούσε να καταστεί δυνατή η δημιουργία ενός πρωτοκόλλου, με τροποποίηση του υπάρχοντος, για τη δημιουργία νευρώνων του μεσεγκέφαλου και, συγκεκριμένα, τη δημιουργία ντοπαμινεργικών νευρώνων. Στο πλαίσιο αυτό στην παρούσα μελέτη, αρχικά, πραγματοποιήθηκε η επιβεβαίωση των επιπέδων των γονιδίων με real-time RT PCR και συνακόλουθα έγινε προσθήκη κατά τον επαναπρογραμματισμό των παραγόντων Shh και Fgf8 με στόχο την επαγωγή μονοπατιώνδημιουργίας ντοπαμινεργικών νευρώνων. Οι επαγόμενοι νευρώνες αναλύθηκαν με τεχνικές real-time RT PCR, ανοσοκυτταροχημεία και ηλεκτροφυσιολογίας, ώστε να αποδειχθεί το κατά πόσο οι παράγοντες Shh και Fgf8 έχουν τη δυνατότητα ώθησης των κυττάρων προς τη ντοπαμινεργική μοίρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν, πως η ταυτόχρονη προσθήκη των Shh και Fgf8 ενισχύει την ωρίμανση και την πολυπλοκότητα των επαγόμενων νευρώνων ενώ σε μεταγραφικό επίπεδο παρατηρείται η μείωση των επιπέδων μεταγραφικών παραγόντων των ανώριμων ντοπαμινεργικών νευρώνων, όπως ο Lmx1b με ταυτόχρονη αύξηση δεικτών των ώριμων ντοπαμινεργικών νευρώνων, όπως ο DAT. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων μεταγραφικών παραγόντων, οι οποίοι κατέχουν σημαντικό ρόλο για την ανάπτυξη του πρόσθιου εγκεφάλου, όπως οι Tbr1 και Tbr2. Τα παραπάνω δεδομένα υποδεικνύουν την τάση των επαγόμενων νευρώνων προς μία ντοπαμινεργική μοίρα. Τέλος, πραγματοποιήθηκε μία σειρά ηλεκροφυσιολογικών πειραμάτων, σύμφωνα με την οποία οι επαγόμενοι νευρώνες μετά από προσθήκη των Shh και Fgf8 είχαν καλύτερη απόκριση σε εκπολωτικά δυναμικά, ήταν λειτουργικοί, αφού παρουσίαζαν διαδοχικά δυναμικά ενέργειας μετά από διέγερση και τέλος είχαν τη δυνατότητα συμμετοχής σε δίκτυα νευρώνων, καθώς παρουσίαζαν και αυθόρμητη μετασυναπτική δραστηριότητα.
