Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Maria Halabalaki, Assistant Professor, School of Pharmacy, National and Kapodistrian University of Athens
Leandros A. Sklatsounis, Professor, School of Pharmacy, National and Kapodistrian University of Athens
Emmanouil Mikros, Professor, School of Pharmacy, National and Kapodistrian University of Athens
Emerson Ferreira Queiroz, Senior Lecturer, School of Pharmaceutical Sciences, University of Geneva
Nikolaos Tentolouris, Professor, School of Medicine, National and Kapodistrian University of Athens
Sofia Mitakou, Professor, School of Pharmacy, National and Kapodistrian University of Athens
Elissavet Dotsika, Researcher A’ , Institute of Nanoscience and nanotechnology, National Center for Scientific Research Demokritos
Περίληψη:
Η φύση αποτελεί μία συνεχή πηγή βιοδραστικών μορίων και σημαντική κατευθηντήρια δύναμη στην ανεύρεση νέων φαρμάκων. Η κύρια πηγή βιοδραστικών φυσικών προϊόντων αποτελούν τα φαρμακευτική φυτά. Είναι αξιοσημείωτο ότι στις μέρες μας, συμπληρώματα διατροφής βασιζόμενα σε φυσικά βιοδραστικά μόρια έχουν εισαχθεί στη ρουτίνα μας, με στόχο τη βελτίωση της ποιότητας ζωής και της υγείας του ανθρώπου. Ωστόσο, ο ορισμός των συμπληρωμάτων διατροφής διαφέρει από χώρα σε χώρα και παγκοσμίως, ελλείπει μία γενική διαχείριση για την ταξινόμηση αυτών των προϊόντων. Η κατηγοριοποίηση τους σε συγκεκριμένες ομάδες φαρμακευτικών προϊόντων είναι δύσκολη λόγω της ύπαρξης μεγάλου αριθμού σκευασμάτων, του ποικίλου περιεχομένου τους και του μεγάλου αριθμού ιδιοτήτων και ισχυρισμών υγείας που δημοσιεύονται κάθε χρόνο.
Η υπάρχουσα νομοθεσία σχετικά με τα προϊόντα αυτά μπορεί να χαρακτηριστεί ως γκρίζα ζώνη και πολλα φαρμακευτικά φυτά/εκχυλίσματα κατηγοριοποιούνται ως τρόφιμα στην Ευρωπαϊκή Ένωση (ΕΕ). Η έλλειψη νομοθεσίας επιτρέπει την εμπορία πολλών σκευασμάτων χωρίς επαρκή ή έγκυρα επιστημονικά δεδομένα, τα οποία σχετίζονται κυρίως με την ποιότητα, την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια. Ακόμη και σε περιπτώσεις όπου περιέχονται δραστικές ενώσεις για τις οποίες η δραστικότητα και η ασφάλεια τους είναι επιστημονικά τεκμηριωμένες, η αναγραφόμενη ποιότητα δεν αντιπροσωπεύει το τελικό προϊόν στην αγορά. Επιπλέον, η αποτελεσματικότητα και η ασφάλεια συνήθως υποτιμώνται, με χαρακτηριστικό παράδειγμα την έλλειψη γνώσης για τη βιοδιαθεσιμότητα των μορίων, η οποία συνδέεται άμεσα με την αποτελεσματικότητα.
Μεταξύ των τροφίμων αυτών, το ελαιόλαδο έχει προσελκύσει το επιστημονικό ενδιαφέρον μετά τη δημοσίευση δύο ισχυρισμών υγείας σχετικά με τη χημική του σύσταση και τις αντίστοιχες θετικές επιπτώσεις στην ανθρώπινη υγεία. Το ελαιόλαδο έχει καθιερωθεί στη συνείδηση των ανθρώπων παγκοσμίως ως ένα από τα ανώτερα θρεπτικά έλαια που προάγουν την υγεία, με εξαιρετικές οργανοληπτικές ιδιότητες. Η μοναδική χημική του σύνθεση είναι υπεύθυνη για τις ευεργετικές του ενέργειες για την υγεία και τη διατροφή. Η χημική του σύνθεση είναι εξαιρετικά πολύπλοκη και εξαρτάται από διάφορους εξωγενείς παράγοντες όπως η ποικιλία του ελαιόδεντρου, οι συνθήκες του μικροκλίματος, η καλλιεργητική πρακτική, η διαδικασία παραγωγής, η αποθήκευση κλπ. Παρόλα αυτά, μέχρι σήμερα δεν υπάρχει μια ικανοποιητική και γενικά αποδεκτή μέθοδος ελέγχου ποιότητας του ελαιολάδου. Λαμβάνοντας υπόψη την οικονομική αξία του για την ΕΕ και ειδικά για τις μεσογειακές χώρες, είναι εξαιρετικά σημαντική η διερεύνηση των παραγόντων που επηρεάζουν τη χημική του σύνθεση, η αναγνώριση ορισμένων χημικών δεικτών καθώς και η θέσπιση κατάλληλης μεθοδολογίας για τον ποιοτικό του έλεγχο.
Προς την αποσαφήνιση της χημικής σύνθεσης του ελαιολάδου, έχουν διεξαχθεί πολυάριθμες μελέτες με στόχο την ταυτοποίηση των συστατικών του αλλά και την διερεύνηση των βιολογικών ιδιοτήτων τους. Πρόσφατα, οι πολυφαινόλες του ελαιολάδου, το μικρό κλάσμα των πολικών του ενώσεων βρίσκονται στο επίκεντρο της έρευνας. Αξίζει να σημειωθεί ότι μέχρι σήμερα υπάρχουν ενώσεις στο ελαιόλαδο οι οποίες δεν έχουν χαρακτηριστεί ακόμα δομικά. Ειδικά, οι πολυφαινόλες του ελαιολάδου χαρακτηρίζονται από σημαντικές βιολογικές ιδιότητες και συνεχώς δημοσιεύονται νέες μελέτες που διερευνούν το ρόλο τους. Ωστόσο, ένα σημαντικό μειονέκτημα που περιπλέκει και καθυστερεί σημαντικά αυτή τη διαδικασία είναι η έλλειψη πρότυπων ενώσεων στην αγορά για τη διερεύνηση της δραστηκότητας τους. Για παράδειγμα, η ολεοκανθάλη (OLEΟ) και η ολεασίνη (OLEΑ) είναι δύο από τα σημαντικότερα σεκοϊριδοειδή του ελαιολάδου που κατηγοριοποιούνται στην ομάδα των πολυφαινολών τα οποία σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες εμφανίζουν πληθώρα ελπιδοφόρων βιολογικών ιδιοτήτων αλλά δεν είναι εμπορικά διαθέσιμες. Έτσι, η καθιέρωση μεθόδων για την απομόνωση σε καθαρή μορφή καθώς και σε ικανοποιητική απόδοση τέτοιων ενώσεων είναι το βασικό βήμα που καθιστά δυνατή την περαιτέρω διερεύνησή τους. Αυτό θα επιτρέψει την εκτέλεση in vitro αλλά και in vivo πειραμάτων που θα διευκολύνουν σημαντικά την αποσαφήνιση του βιολογικού τους ρόλου και κατά συνέπεια θα βοηθήσουν στην αποκρυπτογράφηση των ιδιοτήτων του ίδιου του ελαιολάδου.
Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, προσπαθήσαμε να αναπτύξουμε μεθόδους και προσεγγίσεις με στόχο την απόδοση πιθανών απαντήσεων σε ασάφειες, περιορισμούς και ανεπάρκειες της διαδικασίας ανεύρεσης φαρμάκων από φυσικά προϊόντα. Ως αρχικό υλικό επιλέχθηκε το ελαιόλαδο. Το ελαιόλαδο αποτελεί ένα υλικό-μοντέλο διότι όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, χαρακτηρίζεται από ανεπαρκείς μεθόδους για την αξιολόγηση της ποιότητας του, είναι πλούσια πηγή μεταβολιτών με αξιόλογα βιολογικά αποτελέσματα και έως σήμερα νέοι μεταβολίτες ανακαλύπτονται συνεχώς. Είναι αξιοσημείωτο ότι το ίδιο το ελαιόλαδο ή κάποια από τα συστατικά του, κυκλοφορούν σε διάφορες μορφές στην αγορά ως συμπληρώματα διατροφής. Επιπλέον, οι μελέτες προσδιορισμού της Απορρόφησης, Κατανομής, Μεταβολισμού και Απέκκρισης (ADMΕ μελέτες) καθώς και η in vivo αξιολόγηση των συστατικών αυτών είναι περιορισμένες, ενώ οι μελέτες σε ανθρώπους είναι σχεδόν απούσες. Στο επίκεντρο αυτής της προσπάθειας ήταν η ανάπτυξη χρωματογραφικών και αναλυτικών μεθόδων για την απομόνωση δραστικών ενώσεων, τον ποιοτικό έλεγχο και την ποσοτικοποίηση τους σε διαφορετικά βιολογικά υγρά. Συγκεκριμένα, η μεθοδολογία της φασματομετρία μάζας χρησιμοποιήθηκε εντατικά για την επίτευξη αυτών των στόχων.
Με βάση τα παραπάνω στην παρούσα μελέτη αναπτύχθηκε και στοιχειοθετήθηκε ένας πλήρης ερευνητικός σχεδιασμός διερεύνησης του ελαιολάδου και των συστατικών του. Συγκεκριμένα, ξεκινώντας από μια βιβλιοθήκη δειγμάτων ελαιολάδου (περίπου 300) από όλη την Ελλάδα, εξετάστηκαν πτυχές ελέγχου ποιότητας με στόχο τον προσδιορισμό της επίδρασης συγκεκριμένων ποιοτικών παραμέτρων στη χημική του σύνθεση και τον προσδιορισμό και ταυτοποίηση μορίων-δεικτών. Σημαντικά συστατικά του ελαιολάδου και συγκεκριμένα, υδροξυτυροσόλη (ΗΤ), τυροσόλη (Τ), OLEA και OLEO προσδιορίστηκαν ποσοτικά με βάση τη μέθοδο HPLC-DAD του Διεθνούς Συμβουλίου Ελαιολάδου (IOC). Επιπλέον, εκμεταλλευόμενοι την εξαιρετικά υψηλή διακριτική ικανότητα και την υψηλή ακρίβεια πλατφορμών φασματομετρίας μάζας (HRMS) σε συνδυασμό με χημειομετρικά εργαλεία, προσδιορίστηκαν στατιστικά σημαντικοί μεταβολίτες και συσχετίστηκαν με συγκεκριμένους παράγοντες ποιότητας. Είναι σημαντικό να αναφερθεί πως για πρώτη φορά αναπτύχθηκε μια ολοκληρωμένη προσέγγιση μελέτης του μεταβολικού προφίλ των ελληνικών ελαιολάδωνν με δύο διαφορετικές πλατφόρμες HRMS και δημιουργήθηκε ένας κατάλογος ενώσεων-δεικτών και των παραμέτρων ποιότητας που μελετήθηκαν.
Τα σεκοϊριδοειδή βρέθηκαν να είναι μία από τις σημαντικότερες χημικές κατηγορίες στον κατάλογο αυτό. Έτσι, απομονώθηκαν επιλεγμένα παράγωγα σεκοϊριδοειδών και πρόσφατα απομονωμένα παράγωγα ιριδοειδών για την εκτέλεση in vitro και iη νiνο δοκιμών καθώς και μιας φαρμακοκινητικής μελέτης. Οι OLEO και OLEA ήταν δύο από αυτά τα μόρια, που χαρακτηρίζονται από ισχυρές αντιφλεγμονώδεις και αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Τα δύο μόρια καθώς και τρία εκχυλίσματα πολυφαινολών (TPF) με υψηλά, μεσαία και χαμηλά επίπεδα αυτών των μεταβολιτών ελέγχθηκαν in vitro προς αξιολόγηση της κυτταροτοξικότητας και ενεργότητας του πρωτεασώματος σε κύτταρα ανθρώπινων ινοβλαστών. Επιπλέον, τα TPF χορηγήθηκαν ως συμπλήρωμα διατροφής σε ένα in vivo μοντέλο Drosophilla για τη διερεύνηση του αντικτύπου τους στην υγιή γήρανση. Τόσο τα μόρια όσο και το TPF αποκάλυψαν θετικό συσχετισμό με τις κυτταροπροστατευτικές οδούς προαγωγής της υγιούς γήρανσης και κατέστειλαν το οξειδωτικό στρες τόσο σε κύτταρα θηλαστικών όσο και στις μύγες. Ακολούθως, σχεδιάστηκε ένα in vivo μοντέλο ποντικού για τον προσδιορισμό των φαρμακοκινητικών χαρακτηριστικών της OLEO. Για πρώτη φορά διερευνήθηκε ο μεταβολισμός της OLEO και οι βιομετατραπές της σε in vivo μοντέλο.
Ένας άλλος στατιστικά σημαντικός μεταβολίτης ήταν η ΗΤ η οποία αποτελεί επίσης συστατικό πολλών συμπληρωμάτων διατροφής. Έτσι, σχεδιάστηκε και διεξήχθη μια μελέτη παρέμβασης σε ανθρώπους για τη διερεύνηση της επίδρασης μιας εμπλουτισμένης σε ΗΤ μαλακής κάψουλας χορηγούμενη σε δύο διαφορετικές δόσεις (5mg / ημέρα και 15mg / ημέρα), σε παχύσαρκες / υπέρβαρες γυναίκες σε διπλά τυφλή μελέτη για περίοδο έξι μηνών. Η κάψουλα αξιολογήθηκε αρχικά για την τελική της ποιότητα. Ταυτοποιήθηκε το σύνολο των συστατικών της και προσδιορίσθηκε με ακρίβεια η τελική συγκέντρωση ΗΤ στην κάψουλα. Μια στοχευμένη μεθοδολογία UPLC-triplequadropole-MS αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό του ΗΤ στα ούρα των εθελοντών κατά τη διάρκεια ολόκληρης της περιόδου παρέμβασης και καθορίστηκαν τα επίπεδα απέκκρισης της. Ακολούθως, αναπτύχθηκε μια μη στοχευμένη HRMS μέθοδος για την εξερεύνηση του μεταβολικού προφίλ αίματος και ούρων των εθελοντών κατά τη διάρκεια της παρέμβασης. Οι αντιδράσεις βιομετατροπής της ΗΤ εξερευνήθηκαν και εντοπίστηκαν πιθανά προϊόντα μεταβολισμού της φάσης Ι και II. Στατιστικά σημαντική απώλεια βάρους και λίπους παρατηρήθηκε μετά από έξι μήνες χορήγησης του συμπληρώματος σε υψηλές δόσεις (15mg / ημέρα) και είναι η πρώτη φορά που η ΗΤ σχετίζεται με την παχυσαρκία σε ανθρώπους. Επιπλέον, φαινόταν να ακολουθούνται διαφορετικές βιοσυνθετικές οδοί ανάλογα με τη συμπληρωμένη δόση. Χρησιμοποιώντας προσεγγίσεις μεταβολομικής προέκυψαν νέα δεδομένα σχετικά με τη συσχέτιση ορισμένων ενδογενών μεταβολιτών με τη χορήγηση ΗΤ.
