Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Σιμοπούλου Μαρία, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ, Επιβλέπουσα
Μαστοράκος Γεώργιος, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Φιλίππου Αναστάσιος, Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Η υπογονιμότητα επηρεάζει όλο και περισσότερα ζευγάρια στις μέρες μας, καθιστώντας αναγκαία την ανεύρεση αιτιών και την εφαρμογή της καταλληλότερης θεραπείας. Η φυσιολογία των ανδρών, ωστόσο, και ο μηχανισμός του αναπαραγωγικού τους συστήματος είναι πολύπλοκοι και απαιτούν εντατική και συνεχή έρευνα. Ο ινσουλινο-μιμητικός αυξητικός παράγοντας 1 (insulin-like growth factor – I, IGF-I) έχει προταθεί ως ένας παράγοντας που μπορεί να διαδραματίσει κεντρικό ρόλο στην ανδρική υπογονιμότητα λόγω της δράσης του στον αναβολισμό και του διαφορικού τρόπου έκφρασης των τριών ισομορφών του σε πολλές άλλες παθολογικές καταστάσεις. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της ενδεχόμενης ύπαρξης διαφορικής έκφρασης των τριών ισομορφών του IGF-I μεταξύ νορμοζωοσπερμικών ανδρών και εκείνων με μη φυσιολογικές παραμέτρους σπέρματος, καθώς και η πιθανή συσχέτιση ενός διαφορετικού προτύπου έκφρασης των ισομορφών με την ανδρική υπογονιμότητα. Σαράντα δείγματα σπέρματος συλλέχθηκαν από άνδρες ηλικίας 32 έως 54 ετών(43.9 ± 4.6). Κάθε δείγμα σπέρματος εκτιμήθηκε για την ποιότητά του σύμφωνα τα κριτήρια του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας. Όλοι οι συμμετέχοντες έδωσαν την έντυπη συγκατάθεσή τους. Σύμφωνα με τον αριθμό των ανώμαλων παραμέτρων που παρατηρήθηκαν στην ανάλυση σπέρματος τους, οι συμμετέχοντες κατηγοριοποιήθηκαν σε 4 ομάδες μελέτης: «Normozoospermic», «Single defect», «Double defect» και «Oligoasthenoteratozoospermic (ΟΑΤ)». Αρχικά, τα δείγματα αραιώθηκαν με PBS σε τελική συγκέντρωση 10x106 σπερματοζωάρια ανά mL και υποβλήθηκαν σε οσμωτικό σοκ για την εξάλειψη των μη γαμετικών κυττάρων. Το ολικό RNA απομονώθηκε από τα σπερματοζωάρια με το πρωτόκολλο TRItidy GTM σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση και η καθαρότητα του RNA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο. Ακολούθησε η σύνθεση του συμπληρωματικού DNA (cDNA) για κάθε δείγμα με το Protoscript II First Strand cDNA synthesis kit. Η ποσοτικοποίηση του cDNA στη συνέχεια διεξήχθη μέσω αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (q-PCR) χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές για τις τρεις ισομορφές του IGF-I και το18s rRNA ως γονίδιο αναφοράς. Ταυτόχρονα, οι πρωτεΐνες των σπερματοζωαρίων απομονώθηκαν με το πρωτόκολλο TRItidy GTM και χρησιμοποιήθηκαν παράλληλα με το σπερματικό πλάσμα για την ανίχνευση της ισόμορφης IGF-IEc σε πρωτεϊνικό επίπεδο μέσω της τεχνικής Western Blot. Η στατιστική ανάλυση των παραπάνω δεδομένων διεξήχθη στο υπολογιστικό περιβάλλον της R. Το IGF-IEc mRNA ανιχνεύθηκε και στα 40 δείγματα της μελέτης ανεξάρτητα από την παθολογία του σπέρματός τους, ωστόσο, η ισομορφή IGF-IEc δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε επίπεδο πρωτεΐνης, ενδεχομένως λόγω της μη επαρκούς ποσότητας πρωτεΐνης που απομονώθηκε και χρησιμοποιήθηκε κατά την ανάλυση ανοσοαποτύπωσης (western blot). Επιπλέον, το mRNA της ισομορφής IGF-IEa ανιχνεύθηκε σε ένα μεμονωμένο άτομο. Δύο από τα 40 δείγματα φάνηκε να εκφράζουν την ισομορφή IGF-IEb, αλλά μόνο η αλληλούχιση του προϊόντος της PCR θα μπορούσε να το επιβεβαιώσει. Ακόμα, τα επίπεδα mRNA του IGF-IEc στην ομάδα "Normozoospermic" ήταν χαμηλότερα από την ομάδα “Double defect” (5.1 ± 8.5, p-value=0.0117*) και τους "OAT" (2.9 ± 2.3, p-value=0.0072*). Επιπλέον, βρέθηκε αρνητική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων mRNA της ισομορφής IGF-IEc και τριών από τις παραμέτρους του σπέρματος: ολικός αριθμός σπερματοζωαρίων (r=-0.3895225, p-value=0.01298), προωθητική κινητικότητα (r=-0.4505146, p-value= 0.003532) και ολική κινητικότητα(r =-0.3790446, p-value=0.01586). Αυτή η μελέτη ανέδειξε για πρώτη φορά την έκφραση των ισομορφών του IGF-I σε επίπεδο mRNA σε σπερματοζωάρια. Ειδικότερα, τα ευρήματα της μελέτης υποδηλώνουν πιθανή συσχέτιση των επιπέδων mRNA τoυ IGF-IEc με την ανδρική υπογονιμότητα, οφειλόμενη σε 2 ή περισσότερες ανωμαλίες στις παραμέτρους του σπέρματος, και φαίνεται ότι στα σπερματοζωάρια οι δράσεις του ΙGF-I διαμεσολαβούνται κυρίως από την ισομορφή IGF-IEc. Επιπλέον, η αρνητική συσχέτιση των επιπέδων mRNA τoυ IGF-IEc με τον ολικό αριθμό σπερματοζωαρίων, την προωθητική και την ολική κινητικότητα τους υποδεικνύει ότι τα υψηλά επίπεδα της ισομορφής IGF-IEc επηρεάζουν αρνητικά τη σπερματογένεση και τη διαδικασία ωρίμανσης των σπερματοζωαρίων. Ωστόσο, περαιτέρω μελέτες με μεγαλύτερο μέγεθος δείγματος απαιτούνται για να εξακριβωθεί το πρότυπο έκφρασης των ισομορφών και η επίδραση τους στην ποιότητα του σπέρματος και στη σπερματογένεση.
Λέξεις-κλειδιά:
IGF-1, Ισομορφές, Ανδρική υπογονιμότητα, Διαφορική έκφραση