Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Παντελής Χατζής, Ερευνητής Β', ΕΚΕΒΕ Φλεμινγκ
Παναγιώτα Καφασλα, Ερευνήτρια Γ, ΕΚΕΒΕ Φλεμινγκ
Δέσποινα Σανουδου, Επίκουρη Καθηγήτρια Ιατρική Σχολής, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Το σηματοδοτικό μονοπάτι WNT παίζει καθοριστικό ρόλο στην διατήρηση των βλαστικών κυττάρων και ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων-στόχων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη, στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την ανανέωση του εντερικού επιθηλίου. Η συνεχής, μη φυσιολογική ενεργοποίηση του κανονικού μονοπατιού WNT προκαλείται από μεταλλάξεις σε γονίδια όπως τo APC, ΑΧΙΝ και CTNNB1 και αποτελεί το πρώτο βήμα για την έναρξη και εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Μέχρι τώρα, οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην ρύθμιση των γονιδίων στόχων του μονοπατιού β-κατενίνη/WNT, λόγω της πολυπλοκότητάς τους, δεν έχουν διευκρινιστεί πλήρως. Ωστόσο, υπάρχουν ενδείξεις ότι μια πληθώρα γονιδιακών στόχων και ρυθμιστικών στοιχείων του συμπλέγματος β-κατενίνη/TCF4 εδράζονται σε μη κωδικές περιοχές του γονιδιώματος και αναφέρουν την ύπαρξη μακρών μη κωδικών RNA που μεσολαβούν στις μεταγραφικές αποκρίσεις των κυττάρων. Η έρευνά μας εντόπισε το lnc-IGSF9, ένα μακρό μη κωδικό RNA του οποίου η έκφραση εμφανίζεται μειωμένη σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και το οποίο ρυθμίζεται αρνητικά από το σηματοδοτικό μονοπάτι β-κατενίνη/WNT. Η υπερέκφραση του lnc-IGSF9 κοντά στο σημείο σύνθεσής του με το σύστημα CRISPRa, σε καρκινικές κυτταρικές σειρές του παχέος εντέρου αυξάνει την έκφραση γονιδίων που ελέγχουν την κυτταρική πρόσφυση, προάγοντας τελικά την κυτταρική διαφοροποίηση. Μεταξύ των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων, διακρίναμε το IGSF9, ένα γειτονικό γονίδιο πλησίον του lnc-IGSF9, ως πιθανό μεσολαβητή της λειτουργίας lnc-IGSF9. Η IGSF9 είναι μια πρωτεΐνη προσκόλλησης κυττάρων, μειωμένη έκφραση της οποίας συσχετίζεται έντονα με την εκδήλωση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Περαιτέρω λειτουργικά πειράματα έδειξαν ότι τα lnc-IGSF9 και IGSF9 ακολουθούν παρόμοιο μοτίβο έκφρασης, με το lnc-IGSF9 να επηρεάζει άμεσα την έκφραση IGSF9 αλλά όχι το αντίστροφο. Η ανάλυση πειραμάτων ChIP-seq με αντίσωμα έναντι της β-κατενίνης σε καρκινικές κυτταρικές σειρές του παχέος εντέρου αποκάλυψε δύο ισχυρές θέσεις δέσμευσης στον τόπο ενδιαφέροντος, συγκεκριμένα στον υποκινητή και σε έναν πιθανό ενισχυτή του lnc-IGSF9. Η αφαίρεση(Knock-out) αυτών των δύο τόπων και η επακόλουθη ανάλυση της έκφρασης τους έδειξε ότι η απουσία του ενισχυτή δεν επηρεάζει την έκφραση του lnc-IGSF9, γεγονός που υποδεικνύει ότι η σημασία του στον μηχανισμό μπορεί να είναι δευτερεύουσα. Από την άλλη πλευρά, η αφαίρεση του υποκινητή με την χρήση της τεχνικής CRISPR/Cas9 είχε ως αποτέλεσμα τη μη έκφραση του lnc-IGSF9 όπως ήταν αναμενόμενο. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μικρή επίδραση στην έκφραση του IGSF9 που αποδόθηκε στην ήδη χαμηλή έκφρασή του στις καρκινικές κυτταρικές σειρές του παχέος εντέρου που χρησιμοποιήθηκαν. Παράλληλα, διερευνήσαμε το ρόλο του μεταγραφικού παράγοντα CDX2, μιας πρωτεΐνης που έδειξε να αλληλεπιδράει με το lnc-IGSF9 σε πειράματα RNA pull-down. Η ανάλυση διαθέσιμων δεδομένων ChIP-seq σε κύτταρα LS174T παρουσίασε το πρότυπο δέσμευσης της πρωτεΐνης CDX2. Συγκεκριμένα, το CDX2 δεσμεύεται έντονα τόσο στον υποκινητή όσο και στην περιοχή του ενισχυτή του lnc-IGSF9, υποδεικνύοντας τον πιθανό ρόλο του στη ρύθμιση της έκφρασης lnc-IGSF9. Επιπλέον πειράματα δείχνουν σαφώς ότι η υπερέκφραση της πρωτεινης CDX2 προκαλεί αύξηση της έκφρασης των lnc-IGSF9 και IGSF9, προτείνοντας έναν ρυθμιστικό μηχανισμό μεταξύ των τριών αυτών στοιχείων ο οποίος ενδέχεται να εκτρέπεται κατά την διάρκεια της καρκινογένεσης. Τέλος, πρέπει να γίνει περαιτέρω έρευνα ώστε να προσδιοριστεί ο ακριβής μηχανισμός δράσης του lnc-IGSF9 και η συμβολή της πρωτεΐνης CDX2 στην ρύθμιση του γειτονικού γονιδίου IGSF9.
Λέξεις-κλειδιά:
Μονοπάτι WNT, Καρκίνος, Πρωτεΐνη CDX2, Μεγάλα μη κωδικά RNA, Β-κατενίνη, IGSF9
