Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Ανδρέας Σκορίλας, Καθηγητής Κλινικής Βιοχημείας, Τομέας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Περίληψη:
Ο καρκίνος της ουροδόχου κύστεως (Bladder Cancer, BlCa) αποτελεί την 10η
πιο συχνή μορφή καρκίνου σε παγκόσμιο επίπεδο και τη 2η πιο κοινή μορφή κακοήθειας του ουρογεννητικού συστήματος του αντρικού πληθυσμού - μετά τον καρκίνο του προστάτη - στις χώρες με υψηλό δείκτη ανάπτυξης (Human Development Index, HDI). Ο επιπολασμός της νόσου είναι υψηλότερος στους άνδρες και η συχνότητα διάγνωσής αυξάνει με το πέρας της ηλικίας. Ο καρκίνος της ουροδόχου κύστεως χαρακτηρίζεται από υψηλό βαθμό ετερογένειας σε κυτταρικό και μοριακό επίπεδο, καθώς άτομα με όμοια κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά εμφανίζουν διαφορές ως προς την πρόγνωση της νόσου και την απόκριση τους στα θεραπευτικά πρωτόκολλα. Ανακύπτει, επομένως, η ανάγκη ακριβούς πρόγνωσης για την εφαρμογή εξατομικευμένων πρωτοκόλλων αποτελεσματικής θεραπείας και μεταθεραπευτικής παρακολούθησης (follow-up) των ασθενών. Ωστόσο, οι προγνωστικοί δείκτες που χρησιμοποιούνται στην κλινική πράξη αδυνατούν να προσδιορίσουν με ακρίβεια την πορεία έκβασης της νόσου, με αποτέλεσμα οι πλειοψηφία των ασθενών να υποβάλλεται σε επεμβατική θεραπεία καθώς και μακροπρόθεσμες μετεγχειρητικές παρακολουθήσεις, μέσω κυστεοσκοπήσεων, κυτταρολογικής εξέτασης ούρων και CT-MRI απεικονιστικών μεθόδων. Η συνθήκη αυτή έχει ως επακόλουθο την υποβάθμιση της ποιότητας ζωής των ασθενών, καθώς και την αύξηση του κόστους διαχείρισης του καρκίνου της ουροδόχου κύστεως, καθιστώντας την συγκεκριμένη κακοήθεια ως την πιο κοστοβόρα ανά ασθενή, επιβαρύνοντας σημαντικά τα συστήματα υγείας. Ως εκ τούτου, η μελέτη και ταυτοποίηση νέων μοριακών βιοδεικτών, οι οποίοι θα συνεισφέρουν στην βελτίωση της διάγνωσης, της πρόγνωσης των ασθενών ουροθηλιακού καρκίνου και θα μπορούν να εφαρμοσθούν στις πρακτικές της κλινικής ρουτίνας, χαρακτηρίζεται από έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον.
Οι τεχνικές της υγρής βιοψίας και ιδιαίτερα η ανάλυση του ελεύθερου κυττάρων DNA (cell-free DNA, cfDNA), αποτελούν ένα πεδίο έντονης ερευνητικής μελέτης. Η ανάλυση του cfDNA στην σύγχρονη μοριακή διαγνωστική πλεονεκτεί λόγω της μειωμένης επίδρασης της ετερογένειας των όγκων (tumor heterogeneity), καθώς και ο μη επεμβατικός της χαρακτήρας της λήψης των δειγμάτων, αποφεύγοντας την εκδήλωση πιθανών επιπλοκών και περιορίζοντας το υψηλό κόστος παρακολούθησης των ασθενών. Το cfDNA απελευθερώνεται στην κυκλοφορία μέσω μηχανισμών κυτταρικού θανάτου και ιδιαίτερα της απόπτωσης και έχει μικρό χρόνο ημιζωής, συνιστώντας ένα μοριακό στιγμιότυπο του οργανισμού. Επίσης, τα βιολογικά υγρά εμπλουτίζονται με cfDNA από όλα τα κύτταρα του οργανισμού (φυσιολογικά κύτταρα, καρκινικά κύτταρα, κύτταρα από το μικροπεριβάλλον του όγκου). Επομένως, κλάσμα του cfDNA αποτελείτο cfDNA των όγκων (circulating tumor DNA, ctDNA), βάσει του οποίου μπορούν να ανιχνεύονται μεταλλάξεις ειδικές για διάφορους τύπους καρκίνου που έχουν κλινική αξία στην πρόγνωση της νόσου και την πρόβλεψη ανταπόκρισης στην θεραπεία. Οι μεταλλαγές αυτές μπορεί να αφορούν σημειακές μεταλλάξεις, απαλοιφές ή πολλαπλασιασμούς γενετικών τόπων, δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες, καθώς και μη φυσιολογικές επιγενετικές τροποποιήσεις. Μέχρι σήμερα, έχουν εγκριθεί από τον Οργανισμό Ελέγχου Φαρμάκων και Τροφίμων των Η.Π.Α. (Food and Drug Administration, FDA) δύο εφαρμογές του cfDNA στην σύγχρονη μοριακή διαγνωστική των ανθρωπίνων κακοηθειών (EGFR Mutation Test v2 , Epi proColon).
Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η ανάπτυξη νέων μεθοδολογιών ανάλυσης του cfDNA σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστεως και η κλινική αξιολόγησή του για την πρόγνωση και εξέλιξη της νόσου.
Στη παρούσα διπλωματική εργασία, αξιοποιήθηκαν στο σύνολο 170 ιστοτεμάχια όγκων και 100 δείγματα ορού περιφερικού αίματος ασθενών με καρκίνο ουροδόχου κύστης. Αναπτύχθηκε και βελτιστοποιήθηκε πρωτόκολλο απομόνωσης του cfDNA από τον ορό, ποσοτικοποίησής του, καθώς και εκτίμησης της ποιότητας του. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη και βελτιστοποίηση μεθοδολογιών ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου (real-time qPCR), με τη χρήση της χημείας SYBR Green και της μεθόδου σχετικής ποσοτικοποίησης 2-ΔΔCT για τον προσδιορισμό της ακεραιότητας του
cfDNA καιτου αριθμού των αντιγράφων των αλληλομόρφων τριών γονιδίων στόχων, CDKN2A, MDM2 και CCND1, τόσο σε δείγματα ορού όσο και σε δείγματα ιστού ασθενών με καρκίνο στην ουροδόχο κύστη. Στην συνέχεια έγινε κλινική αξιολόγηση, μέσω εκτενούς βιοστατιστικής ανάλυσης, της ποσότητας και της ακεραιότητας του cfDNA, καθώς και του αριθμού των αλληλικών αντιγράφων (copy number variation, CNV) των τριών γονιδίων στόχων (CDKN2A, CCND1,MDM2).
Στο πλαίσιο της διπλωματικής εργασίας, βελτιστοποιήθηκε πρωτόκολλο απομόνωσης του cfDNA από ορό περιφερικού αίματος, καθώς και real-time qPCR πρωτόκολλα ανάλυσης του αριθμού των αντιγράφων (CNVs) των CDKN2A, CCND1, MDM2 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστεως. Από τα αποτελέσματα της κλινικής αξιολόγησης, φαίνεται ότι στον καρκίνο της ουροδόχου κύστεως, η αύξηση του σταδίου της νόσου οδηγεί σε ενίσχυση των μονοπατιών του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου έναντι της νέκρωσης. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι το CDKN2A γονίδιο έχει μεγαλύτερο αντίκτυπο στους ασθενείς με μη μυοδιηθητική νόσο, καθώς ασθενείς με ομόζυγη ή ετερόζυγη απαλοιφή του συγκεκριμένου γενετικού τόπου εμφανίζουν καλύτερη επιβίωση. Το MDM2 γονίδιο έχει μεγαλύτερο αντίκτυπο στους ασθενείς με μυοδιηθητική νόσο, καθώς ασθενείς με πολλαπλασιασμό του συγκεκριμένου γενετικού τόπου εμφανίζουν δυσμενέστερη επιβίωση. Τα επίπεδα εμφάνισης των CDKN2A και MDM2 γονιδίων στον ορό των ασθενών με επιφανειακό και υψηλής διαφοροποίησης καρκίνο είναι σημαντικά χαμηλότερα συγκριτικά με τους ασθενείς προχωρημένου σταδίου και υψηλού βαθμού κακοήθειας καρκίνου. Οι μη μυοδιηθητικοί, χαμηλού βαθμού κακοήθειας όγκοι έχουν καλύτερη πρόγνωση, οι προαναφερθέντες ενδείξεις ίσως να αποτελούν έναν καλό προγνωστικό δείκτη, κάτι που χρήζει βέβαια περαιτέρω επιβεβαίωσης με ανάλυση επιβίωσης σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων ορού. Συμπερασματικά, το cfDNA φαίνεται να είναι ένα πολλά υποσχόμενο βιομόριο στην βελτίωση της διαχείρισης του καρκίνου, καθώς μέσω της ανάλυσής του καθίσταται εφικτός ο προσδιορισμός του συνολικού μοριακού προφίλ των όγκων μη επεμβατικά. Παρ’ όλα ταύτα, είναι αναγκαία η περαιτέρω μελέτη του, για την διασαφήνιση πτυχών της βιολογίας του και των τρόπων αξιοποίησής του στην ιατρική ακριβείας.
