Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Σκορίλας Ανδρέας, Καθηγητής Κλινικής Βιοχημείας, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Το ανθρώπινο γονίδιο της survivin, επίσης γνωστό και ως BIRC5 (NM_001168.2) αποτελεί μέλος της γονιδιακής οικογένειας των αναστολέων της απόπτωσης IAP. Οι πρωτεΐνες IAP ασκούν τη ρυθμιστική τους δράση μέσω πρόσδεσής τους στις κασπάσες 3, 7 και 9, καταστέλλοντας με τον τρόπο αυτό τη δράση τους. Αν και τα επίπεδα έκφρασης της survivin είναι χαμηλά σε πλήρως διαφοροποιημένα κύτταρα και / ή ιστούς, μπορεί να βρεθούν σημαντικά αυξημένα σε ορισμένες παθολογικές καταστάσεις, καθώς και σε κακοήθεις όγκους. Πολυάριθμες έρευνες έχουν καταδέιξει την σημασία του γονιδίου BIRC5 αλλά και των εναλλακτικών του μεταγράφων στην εμφάνιση του καρκίνου και την πορεία και την έκβαση της νόσου. Οι συμβατικές τεχνικές κλωνοποίησης και προσδιορισμού αλληλουχίας έχουν ήδη επιβεβαιώσει ότι εναλλακτικά γεγονότα ματίσματος εντός του πρόδρομου mRNA της survivin έχουν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία πέντε διαφορετικών εναλλακτικών μεταγράφων του γονιδίου. Στην παρούσα μελέτη, ωστόσο, εφαρμόσαμε μια καινοτόμο μεθοδολογία στοχευμένης αλληλούχησης DNA (DNA-sequencing, DNA-seq) με τη χρήση της τεχνολογίας αλληλούχησης επόμενης γενιάς (Next-Generation Sequencing, NGS) για τον εντοπισμό νέων εναλλακτικών μεταγράφων της survivin .
Οι τεχνολογίες αλληλουχίας επόμενης γενιάς (NGS) αποτελούν βασικό εργαλείο των ερευνητών για την ανακάλυψη νέων γεγνότων εναλλακτικού ματίσματος αλλα και για την κατανόηση του ρόλου που διαδραματίζει το εναλλακτικό μάτισμα σε μείζονες κυτταρικές διαδικασίες όπως η καρκινογένεση. Στη παρούσα εργασία λοιπόν χρησιμοποιήθηκε η τεχνολογία αλληλούχισης επόμενης γενίας NGS προκειμένου να γίνουν γνωστά νέα εναλλακτικά αντίγραφα του γονιδίου BIRC5 σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών με πολλές διαφορετικές προελεύσεις. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε εκχύλιση ολικόυ RNA από 17 ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές και συντέθηκε cDNA με τη μέθοδο της αντίστροφης μεταγραφής, χρησιμοποιώντας έναν ολιγο-dT-προσαρμογέα ως εκκινητή προκειμένου να γίνει επιλεκτική αντίστροφη μεταγραφή των mRNAs του γονιδίου. Μετά την παραγωγή του cDNA, πραγματοποιήθηκε touchdown PCR για τη μοριακή κλωνοποίηση όλων των μεταγραφών BIRC5. Όλα τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν και πραγματοποιήθηκε προετοιμασία και ποσοτικός προσδιορισμός της βιβλιοθήκης. Στο επόμενο βήμα πραγματοποιήθηκε αλληλούχηση επόμενης γενίας στο Ion Torrent Personal Genome Machine™.
Μετά τη συγκέντρωση των δεδομένων που λάβαμε από την αλληλούχηση ακολούθησε η βιοπληροφορική ανάλυση των αποτελεσμάτων η οποία αποκάλυψε αρκετές νέες θέσεις ματίσματος μεταξύ γνωστών εξωνίων του γονιδίου survivin, καθώς και την ύπαρξη ενός νέου εξωνίου μήκους 117 νουκλεοτιδίων, το οποίο εκτείνεται μεταξύ των γνωστών εξωνίων 3 και 3Β. Η επικύρωση των ευρημάτων του NGS πραγματοποιήθηκε μέσω αντιδράσεων PCR με τη χρήση ειδικών εκκινητών για κάθε νέο εναλλακτικό μετάγραφο. Με τον τρόπο αυτό, πραγματοποιήθηκε η ταυτοποίηση δεκατεσσάρων νέων εναλλακτικών μεταγράφων του γονιδίου survivin (BIRC5 v.4 - v.17), τα οποία με βάση τα αποτελέσματα της PCR εμφανίζουν ένα ευρύ προφίλ έκφρασης σε μια μεγάλη ομάδα ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών που προέρχονται από δεκαέξι ανθρώπινες κακοήθειες.
Αν και η μελέτη μας παρέχει μια ξεκάθαρη επισκόπηση των mRNAs της survivin που παράγονται από το πρόδρομο mRNA, η βιολογική λειτουργία όλων των νέων εναλλακτικών μεταγράφων καθώς και των πιθανών ισομορφών πρωτεϊνών θα πρέπει να διερευνηθεί στο εγγύς μέλλον. Οι μελλοντικές μελέτες θα μπορούσαν επίσης να επικεντρωθούν στις πιθανές αλληλεπιδράσεις αυτών των ισομορφών με το κύριο μετάγραφο της survivin καθώς και στις μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις. Τέτοιες μελέτες θα παρέχουν πληροφορίες σχετικά με το ρόλο της ισορροπίας μεταξύ των ισομορφών survivin στον κακοήθη πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση, παρέχοντας νέους διαγνωστικούς και προγνωστικούς βιοδείκτες, καθώς και νέους θεραπευτικούς στόχους. Επιπλέον η μελέτη της έκφρασης των εναλλακτικών μεταγράφων της survivin σε καρκινικούς και φυσιολογικούς ιστούς, μέσω της οποίας θα δοθεί η δυνατότητα να διευκρινιστούν οι πραγματικές διαδικασίες ρύθμισης της μεταγραφής τους, καθώς και οι πιθανές αλληλεπιδράσεις των μορίων αυτών σε πραγματικούς κυτταρικούς ιστούς αποτελεί βασικό κομμάτι μελλοντικών ερευνών.
Λέξεις-κλειδιά:
Εναλλακτικό μάτισμα, αλληλούχηση επόμενης γενιάς, γονίδιο survivin,
