Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Σκαλτσούνης Αλέξιος-Λέανδρος, Καθηγητής του Τομέα Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, Τμήμα Φαρμακευτικής, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Περίληψη:
Το Cannabis sativa L. (Cannabaceae) αποτελεί ετήσιο φυτό, το οποίο καλλιεργείται από την αρχαιότητα ως πηγή ινών, σπορέλαιου, τροφής, καθώς και για θρησκευτικούς, πνευματικούς, ευφορικούς και ιατρικούς σκοπούς. Η συγκεκριμένη εργασία έχει ως στόχο την απομόνωση γνωστών από την ήδη υπάρχουσα βιβλιογραφία δευτερευόντων κανναβινοειδών αλλά και κανναβινοειδών τα οποία πιθανά να χαρακτηριστούν ως νέα φυσικά προϊόντα, από υπερκρίσιμο εκχύλισμα (SFE) βιομηχανικής κάνναβης (C. sativa). Το φυτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε στο πειραματικό μέρος της εργασίας, περιλαμβάνει δείγμα βιομηχανικής (κλωστικής) κάνναβης, ποικιλίας ‘Futura 75’ από την περιοχή των Φαρσάλων. Επιπλέον, στόχο αποτέλεσε η βιολογική αξιολόγηση του υπερκρίσιμου και αιθανολικού (EtOH) εκχυλίσματος, καθώς και των όξινων και ουδέτερων κλασμάτων αυτών. Για τον σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν βιολογικές δοκιμές αναστολής των ενζύμων τυροσινάση και ελαστάση, ενώ επίσης έγινε προσδιορισμός του ολικού φαινολικού φορτίου, των ολικών φλαβονοειδών και αναγωγής της ελεύθερης ρίζας DPPH•.
Για την εκχύλιση του φυτικού υλικού χρησιμοποιήθηκαν τεχνικές εκχύλισης υποβοηθούμενης από υπέρηχους (Ultrasound assisted extraction - UAE), με διαλύτη αιθανόλη καθώς και εκχύλισης με υπερκρίσιμα ρευστά (Supercritical fluid extraction - SFE), με διαλύτη υπερκρίσιμο διοξείδιο του άνθρακα (CO2). Για την κλασμάτωση του υπερκρίσιμου εκχυλίσματος (SFE) χρησιμοποιήθηκαν τεχνικές όπως εκχύλιση κατανομής με φυγοκέντριση (Centrifugal partition extraction - CPE) και χρωματογραφία κατανομής με φυγοκέντριση (Centrifugal partition chromatography - CPC). Τα κλάσματα που παραλήφθηκαν διαχωρίστηκαν περαιτέρω με κλασσικές τεχνικές όπως χρωματογραφία στήλης (Column chromatography - CC) και παρασκευαστική χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (Preparative thin layer chromatography - PrepTLC), αλλά και πιο εξελιγμένες τεχνικές όπως η παρασκευαστική υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (Preparative high pressure liquid chromatography - HPLC). Στον έλεγχο της δομής των εν λόγω μορίων συνέβαλε η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (Nuclear magnetic resonance - NMR) μίας ( 1H-NMR) και δύο διαστάσεων (Two-dimensional NMR - 2D NMR). Σε μία πρώτη εκτίμηση των δεδομένων συνέβαλαν και τα δεδομένα από τις αναλύσεις υγρής χρωματογραφίας συνδεδεμένης με φασματομετρία μαζών υψηλής διακριτικής ικανότητας (Liquid chromatography - High resolution mass spectrometry - LC-HRMS), καθώς και αέριας χρωματογραφίας συνδεδεμένης με φασματομετρία μαζών (Gas chromatography - mass spectrometry - GC-MS).
Από την πειραματική πορεία τελικά απομονώθηκαν δέκα δευτερεύοντα κανναβινοειδή: η κανναβιδιβαρίνη (CBDV), το (R)-κανναβιελσοϊκό οξύ-Α ((R)-CBEA-A), το (S)-κανναβιελσοϊκό οξύ-Α ((S)-CBEA-A), το (S)-κανναβιελσοϊκό οξύ-B ((S)-CBEA-B), η κανναβιγερόλη (CBG), η (S)-κανναβιελσοΐνη (CBE), η κανναβικυκλόλη (CBL), το κανναβιχρωμένιο (CBC), η κανναβικιτράνη (CBCT), η Δ8-τετραϋδροκανναβινόλη (Δ8-THC) και δύο κύρια κανναβινοειδή, η κανναβιδιόλη (CBD) και η Δ9-τετραϋδροκανναβινόλη (Δ9-THC). Επιπέον απομονώθηκε ένα σεσκιτερπένιο, το οξείδιο του καρυοφυλλενίου, και ένα διτερπένιο, η φυτόλη. Τέλος, απομονώθηκαν δύο ανάλογα της κανναβιδιόλης και ένα ανάλογο κανναβιγερόλης, καθώς και τρείς άγνωστες ενώσεις οι οποίες χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης.
Όσον αφορά τις βιολογικές δοκιμές το αιθανολικό εκχύλισμα παρουσίασε το υψηλότερο ποσοστό αναστολής της σταθερής ρίζας DPPH• (40.87%) και ακολούθησε το CBD (39.20%) σε όμοια συγκέντρωση. Σχετικά με το ολικό φορτίο φλαβονοειδών, το όξινο κλάσμα SFE παρουσίασε την μεγαλύτερη συγκέντρωση (90.60 mg/g) και ακολούθησε το αιθανολικό εκχύλισμα (34.30 mg/mL). Το τελευταίο παρουσίασε, επίσης, την μεγαλύτερη συγκέντρωση ολικού φαινολικού φορτίου (24.19 mg/mL). Όσον αφορά τις ενζυματικές δοκιμές, το όξινο κλάσμα SFE παρουσίασε τη σημαντικότερη αναστολή των ενζύμων τυροσινάση (16.44%) και ελαστάση (14.67%).
Λέξεις-κλειδιά:
Βιομηχανική κάνναβη (Cannabis sativa L.), Κανναβιδιόλη, Δευτερεύοντα κανναβινοειδή, Χρωματογραφία κατανομής με φυγοκέντριση, Εκχύλιση κατανομής με φυγοκέντριση, Χρωματογραφικές μέθοδοι διαχωρισμού, Φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού, Φασματομετρία μαζών, Προσδιορισμός ολικού φορτίου φλαβονοειδών, Προσδιορισμός ολικού φαινολικού φορτίου, Αναστολή ενζυματικής δραστικότητας, Αντιοξειδωτική δράση
