Optimization of in vivo gene editing in lung tumors using viral vectors

Διπλωματική Εργασία uoadl:3247488 2 Αναγνώσεις

Μονάδα:
Κατεύθυνση Μοριακή Βιοϊατρική - Μηχανισμοί Ασθενειών, Μοριακές και Κυτταρικές θεραπείες και Βιοκαινοτομία
Βιβλιοθήκη Επιστημών Υγείας
Ημερομηνία κατάθεσης:
2022-11-24
Έτος εκπόνησης:
2022
Συγγραφέας:
Μανέτα Δωροθέα
Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Μαρία Τσουμακίδου, Ερευνήτρια Β', ΙΒΚ, ΕΚΕΒΕ "Αλέξανδρος Φλέμιγκ"
Γεώργιος Κόλλιας, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Χριστόφορος Νικολάου, Ερευνητής Β', ΙΒΚ, ΕΚΕΒΕ "Αλέξανδρος Φλέμιγκ"
Πρωτότυπος Τίτλος:
Optimization of in vivo gene editing in lung tumors using viral vectors
Γλώσσες εργασίας:
Αγγλικά
Μεταφρασμένος τίτλος:
Βελτιστοποίηση in vivo γονιδιακής επεξεργασίας σε όγκους του πνεύμονα χρησιμοποιώντας ιικούς φορείς
Περίληψη:
Τα τελευταία 10 χρόνια, η ανάπτυξη εργαλείων γονιδιωματικής μηχανικής έχει εξελιχθεί, ανοίγοντας ευκαιρίες για in vivo εφαρμογές. Η εμφάνιση της τεχνολογίας του CRISPR-Cas9 παρουσιάζει μεγάλες θεραπευτικές δυνατότητες προσαρμόζοντας τη χρήση εργαλείων που θα επιτρέψουν την ακριβή διόρθωση μεταλλάξεων υπεύθυνων για την εμφάνιση νοσημάτων. Τα συστατικά στοιχεία του CRISPR-Cas9 χρειάζεται να μεταφερθούν με επιτυχία μέσα στα κύτταρα για να ασκήσουν το ρόλο τους. Ως αποτέλεσμα, οι ερευνητές έχουν επίσης επικεντρωθεί στη διερεύνηση διαφορετικών μεθόδων και εργαλείων μεταφοράς του μηχανισμού. Στο πλαίσιο του καρκίνου, οι τεχνολογίες που βασίζονται στο CRISPR έχουν βελτιώσει την κατανόησή μας όσον αφορά τη διάγνωση και τη θεραπεία. Με τη δημιουργία μοντέλων στα οποία έχει προηγηθεί η απαλοιφή γονιδίων ενδιαφέροντος (ΚΟ) και τον χειρισμό ενδογενών γενετικών στοιχείων, η τεχνολογία CRISPR-Cas9 έχει προσφέρει πληροφορίες σχετικά με τις κύριες μεταλλάξεις και την ανταπόκριση στη θεραπεία.
Στην παρούσα μελέτη, στοχεύουμε να πραγματοποιήσουμε τον πρώτο χαρακτηρισμό ως προς το ενδεχόμενο τροποποίησης γονιδίων in vivo, στον πνεύμονα υγιών και ποντικών που φέρουν όγκο. Αρχικά, χρησιμοποιούμε ένα σύστημα λεντιιών 3ης γενιάς που μας επιτρέπει να εξετάζουμε την αποτελεσματικότητα της διαμόλυνσης μέσω ενός φθορίζοντος δείκτη, διαπιστώνοντας έτσι την επιτυχή στόχευση των ινοβλαστών. Στο επόμενο βήμα, πραγματοποιούμε έναν in vitro έλεγχο 3 sgRNA που στοχεύουν τον υποδοχέα 1 του μεταμορφωτικού αυξητικού παράγοντα-β (Tgfbr1). Η επιλογή του γονιδίου βασίζεται στο γεγονός ότι ο Tgfb εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό σε ινοβλάστες που σχετίζονται με τον καρκίνο και έχει αποδειχθεί ότι τους μετατρέπει σε μια εξαιρετικά προκαρκινική κατάσταση που ονομάζεται μυοϊνοβλάστες. Δουλεύουμε με ινοβλάστες που είχαν απομονωθεί προηγουμένως από πνεύμονες ποντικού που φέρουν όγκους και που έχουν διαμολυνθεί ώστε να εκφράζουν συστηματικά Cas9. Για την παραγωγή του ιού sgRNA, χρησιμοποιούμε ένα σύστημα φακοϊού 2ης γενιάς. Μετά την in vitro διαμόλυνση με τα sgRNA, επιλέγουμε αυτό που εμφανίζει την υψηλότερη αποτελεσματικότητα διαγραφής της πρωτεΐνης στην κυτταρική σειρά και πραγματοποιούμε την τελική in vivo δοκιμή. Το ζωικό μοντέλο χρησιμοποιεί το σύστημα TetOn για την επαγωγή της Cas9, που σημαίνει ότι απαιτεί τη χορήγηση δοξυκυκλίνης. Χρησιμοποιώντας αυτό το μοντέλο, μπορούμε να διαμολύνουμε επιτυχώς ινοβλάστες στο μικροπεριβάλλον του όγκου και να παρατηρήσουμε τη μείωση του επιπέδου της του υποδοχέα. Τα δεδομένα μας δείχνουν επίσης μια μείωση στο mRNA του υποδοχέα, υποστηρίζοντας ότι η in vivo δοκιμή γονιδιωματικής επεξεργασίας ήταν επιτυχής.
Καθώς αυτή είναι η πρώτη in vivo μελέτη γενετικής επεξεργασίας στο εργαστήριο και απ’όσο γνωρίζουμε και στο πλαίσιο του καρκίνου του πνεύμονα που εστιάζει στους ινοβλάστες, πιστεύουμε ότι παραθέτουμε υποσχόμενα αποτελέσματα. Θέτουν επίσης τα θεμέλια για διερεύνηση και αφήνουν χώρο για βελτιστοποίηση της τεχνικής. Στην ουσία, επιδεικνύουν την ικανότητα των ενδοεργαστηριακών εργαλείων μηχανικής γονιδιώματος και υποδηλώνουν ότι οι θεραπευτικές εφαρμογές που χρησιμοποιούν ζωικά μοντέλα έχουν ισχυρές δυνατότητες.
Κύρια θεματική κατηγορία:
Επιστήμες Υγείας
Λέξεις-κλειδιά:
In vivo, Καρκίνος πνεύμονα, Γονιδιωματική μηχανική, Λεντιιός, CRISPR/Cas9, Υποδοχέας 1 μεταμορφωτικού αυξητικού παράγοντα-β, Tgfbr1, Ινοβλάστες
Ευρετήριο:
Όχι
Αρ. σελίδων ευρετηρίου:
0
Εικονογραφημένη:
Ναι
Αρ. βιβλιογραφικών αναφορών:
69
Αριθμός σελίδων:
40
Αρχείο:
Δεν επιτρέπεται η πρόσβαση στο αρχείο έως 2025-11-25.

THESIS_MANETA.pdf
9 MB
Δεν επιτρέπεται η πρόσβαση στο αρχείο έως 2025-11-25.