Τμήμα Φαρμακευτικής
Βιβλιοθήκη Σχολής Θετικών Επιστημών

2022-12-02

2022

Νικολάου Παναγιώτα-Ευσταθία

Ιωάννα Ανδρεάδου
Καθηγήτρια Φαρμακολογίας, Τμήμα Φαρμακευτικής, Εθνικό Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

Ευστάθιος Καστρίτης
Καθηγητής Θεραπευτικής –Παθολογίας/Ογκολογίας , Ιατρική Σχολή, Εθνικό Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

Μελέτιος Αθανάσιος Δημόπουλος
Πρύτανης Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, Καθηγητής Αιματολογίας-Ογκολογίας, Εθνικό Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

Κωνσταντίνος E. Βοργιάς
Καθηγητής Bιοχημείας, Τμήμα Βιολογίας Εθνικό Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

Ιωάννης Πιρμεττής
Ερευνητής Α και Διευθυντής Ερευνών στο Ινστιτούτο Πυρηνικών και Ραδιολογικών Επιστημών, Τεχνολογίας, Ενέργειας και Ασφάλειας του ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος

Εμμανουήλ Μικρός
Καθηγητής Φαρμακευτικής Χημείας, Τμήμα Φαρμακευτικής, Εθνικό Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

Ανδρέας Παπαπετρόπουλος
Καθηγητής Φαρμακολογίας, Τμήμα Φαρμακευτικής, Εθνικό Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

Καρδιακή αμυλοείδωση ελαφριών αλυσίδων: Διερεύνηση του υποκείμενου μηχανισμού καρδιοτοξικότητας για την αποκάλυψη νέων στόχων καρδιοπροστασίας

Ελληνικά

Καρδιακή αμυλοείδωση ελαφριών αλυσίδων: Διερεύνηση του υποκείμενου μηχανισμού καρδιοτοξικότητας για την αποκάλυψη νέων στόχων καρδιοπροστασίας

Εισαγωγή: Ο όρος αμυλοείδωση περιλαμβάνει ένα ευρύ φάσμα ασθενειών που χαρακτηρίζονται από λανθασμένη αναδίπλωση πρωτεϊνών και την εναπόθεση ινιδίων αμυλοειδούς σε διάφορους ιστούς. Η αμυλοείδωση ελαφριών αλυσίδων (AL) είναι μία πλασματοκυτταρική δυσκρασία στην οποία κλωνικά πλασματοκύτταρα υπερπαράγουν ελαφριές αλυσίδες ανοσοσφαιρίνης που σχηματίζουν το αμυλοειδές και η καρδιακή συμμετοχή της νόσου σχετίζεται με μειωμένη επιβίωση. Η θεραπεία της AL αμυλοείδωσης στηρίζεται σε χημιοθεραπευτικές προσεγγίσεις που στοχεύουν στην εξάλειψη του πλασματοκυτταρικού κλώνου. Η πρόγνωση της AL βασίζεται στην αξιολόγηση καρδιακών δεικτών όπως τα νατριουρητικά πεπτίδια ή η τροπονίνη ακόμη και αν το αμυλοειδές δεν εντοπίζεται στον καρδιακό ιστό, ωστόσο μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν συγκεκριμένες θεραπείες που να στοχεύουν στην μείωση της μυοκαρδιακής βλάβης. Μάλιστα, οι συνήθεις θεραπείες για την καρδιακή ανεπάρκεια είναι αναποτελεσματικές ή μη ανεκτές στην AL με καρδιακή συμμετοχή. Η πολυπλοκότητα στην AL στηρίζεται στο γεγονός ότι αφενός το αμυλοειδές διαταράσσει την αρχιτεκτονική του ιστού και παράλληλα, οι κυκλοφορούσες ελαφριές αλυσίδες επάγουν καρδιοτοξικότητα. Σήμερα, οι υποκείμενοι μηχανισμοί τοξικότητας δεν έχουν αποσαφηνιστεί και συνεπώς δεν έχουμε καταλήξει σε πιθανούς στόχους καρδιοπροστασίας για την ανάπτυξη νέων φαρμακομορίων και τη βελτίωση της λειτουργίας της καρδιάς.
Σκοπός: Στόχος της διατριβής είναι η σύγκριση της καρδιοτοξικότητας των ελαφριών αλυσίδων που προέρχονται από ασθενείς με AL αμυλοείδωση και καρδιακή συμμετοχή σε σχέση με άλλες πλασματοκυτταρικές δυσκρασίες όπως το πολλαπλούν μυέλωμα (ΜΜ) και η μονοκλωνική γαμμαπάθεια αδιευκρίνιστης σημασίας (MGUS) χωρίς καρδιακές επιπλοκές, ώστε να βελτιώσουμε την κατανόησή μας για τους μηχανισμούς της επαγόμενης καρδιακής βλάβης στην AL. Πιο συγκεκριμένα οι στόχοι της εργασίας είναι 1) η γονιδιακή αλληλούχηση και η βιοτεχνολογική παραγωγή ελαφριών αλυσίδων πλήρους μήκους από ασθενείς με AL και καρδιακή συμμετοχή, από ασθενείς MM, MGUS ή μη κλωνικών ελαφριών αλυσίδων από υγιείς εθελοντές (YE), 2) η διερεύνηση της πιθανής καρδιοτοξικότητας των ελαφριών αλυσίδων σε τρείς διακριτούς κυτταρικούς πληθυσμούς, 3) η διερεύνηση των μηχανισμών τοξικότητας τόσο σε κλινικά δείγματα όσο και in vitro 4) η δημιουργία ενός in vivo μοντέλου καρδιοτοξικότητας από αμυλοειδογόνες ελαφριές αλυσίδες και 5) η δημιουργία ενός μοντέλου με αμυλοείδωμα AL κατάλληλο για τη μελέτη φαρμακομορίων που στοχεύουν στο αμυλοειδές.
Μέθοδοι: Πλασματοκύτταρα CD138+ απομονώθηκαν από τον μυελό των οστών από ασθενείς με AL και καρδιακή συμμετοχή (n=8), με ΜΜ (n=2) και με MGUS (n=2) και μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος απομονώθηκαν από ΥΕ (n=2) για απομόνωση RNA και χαρακτηρισμό του ρεπερτορίου της οικογένειας των γονιδίων των ελαφριών αλυσίδων. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις κλωνικές ελαφριές αλυσίδες και τρείς ελαφριές αλυσίδες από ΥΕ, κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν σε κύτταρα Shuffle E.coli. Η αναδίπλωση των ελαφριών αλυσίδων, ο ολιγομερισμός και η τάση τους για τη δημιουργία αμυλοειδών αξιολογήθηκε μέσω φασματοσκοπίας κυκλικού διχρωϊσμού, ηλεκτροφόρησης και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας αντίστοιχα. Πρωτογενή καρδιομυοκύτταρα μυών (pAVMCs), πρωτογενείς ινοβλάστες από το μυοκάρδιο και πρωτογενή λεία μυϊκά κύτταρα από αορτή εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις ελαφριών αλυσίδων για την αξιολόγηση του κυτταρικού θανάτου και τη διερεύνηση των μηχανισμών καρδιοτοξικότητας. Παράλληλα, προσδιορίστηκαν δείκτες στο πλάσμα ασθενών με AL και πραγματοποιήθηκε πρωτεωμική ανάλυση λίπους ώστε να αναδειχθούν πιθανοί βιοδείκτες και μοριακοί μηχανισμοί που σχετίζονται με τη βλάβη. Για τη δημιουργία ενός in vivo μοντέλου καρδιοτοξικότητας από ελαφριές αλυσίδες, C57BL6 αρσενικοί μύες τυχαιοποιήθηκαν σε 6 ομάδες και υπεβλήθησαν σε ενδοκαρδιακή χορήγηση των τριών καρδιοτοξικών και αμυλοειδογόνων ελαφριών αλυσίδων, των ισοτυπικών ελαφριών αλυσίδων από ΥΕ είτε του διαλύτη. Ακολούθησε υπερηχογραφική αξιολόγηση της καρδιακής λειτουργίας, ιστολογική αξιολόγηση της βλάβης και μελέτη του επαγόμενου μηχανισμού τοξικότητας. Mύες Balb/c τυχαιοποιήθηκαν και ενέθηκαν υποδορίως με διαλύματα πλούσια σε αμυλοειδή που είχαν παρασκευαστεί από αμυλοειδογόνα πεπτίδια ή από ελαφριές αλυσίδες πλήρους μήκους των ασθενών για τη δημιουργία του μοντέλου με AL αμυλοείδωμα. Τρία μόρια που είναι επίπεδα, λιπόφιλα και έχουν την ικανότητα να προσδένονται σε αμυλοειδείς εναποθέσεις της νόσου Alzheimer’s χρησιμοποιήθηκαν ως υποψήφια ραδιοδιαγνωστικά για τον χαρακτηρισμό του μοντέλου με τη βοήθεια απεικόνισης τομογραφίας εκπομπής μονήρους φωτονίου (SPECT) και δοκιμών βιοκατανομής.
Αποτελέσματα: Πραγματοποιήθηκε επιτυχημένη παραγωγή και απομόνωση 7 ελαφριών αλυσίδων πλήρους μήκους ασθενών με AL, 2 από MM, 2 από MGUS και 3 από YE. Όλες οι ελαφριές αλυσίδες είχαν ομοιότητα στη διαμόρφωση ως βήτα πτυχωτή επιφάνεια και στον ολιγομερισμό τους ως μείγμα μονομερών και διμερών. Τέσσερεις ελαφριές αλυσίδες που προέρχονται από τους ασθενείς με AL και καρδιακή συμμετοχή οδήγησαν σε καρδιοτοξικότητα στα pAVMCs που συσχετίστηκε με την ιδιότητα αυτών να σχηματίζουν αμυλοειδή και τρείς από αυτές εμφάνισαν τοξικότητα και στα λεία μυϊκά κύτταρα. Οι ελαφριές αλυσίδες προερχόμενες από YE, MM και MGUS δεν εμφάνισαν κυτταροτοξικότητα. Η πρωτεωμική ανάλυση στα δείγματα αναρροφήματος λίπους των ασθενών με AL αμυλοείδωση ανέδειξε ως σημαντικές σηματοδοτικές οδούς αυτές που σχετίζονται με το ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) και τη φλεγμονή. Αντίστοιχοι μηχανισμοί τοξικότητας εντοπίστηκαν και in vitro στα καρδιομυοκύτταρα όπου η επώαση με τις αμυλοειδογόνες και τοξικές ελαφριές αλυσίδες αύξησαν τους δείκτες του ΕR στρες όπως οι πρωτεΐνες Bip και IRE-1a που στις κάπα ελαφριές αλυσίδες οδηγεί σε αυξημένη απόπτωση και στις λάμδα τύπου αλυσίδες σε αυξημένη αυτοφαγία. Οι κάπα ελαφριές αλυσίδες από ασθενείς με AL, MM και MGUS οδήγησαν σε αυξημένη φλεγμονή, υποδηλώνοντας ότι αυτός ο μηχανισμός είναι ανεξάρτητος από την παρατηρούμενη τοξικότητα. Στη κυκλοφορία των ασθενών με AL αμυλοείδωση εντοπίστηκε αύξηση της κυκλικής μονοφωσφορικής γουανοσίνης (cGMP) που συσχετίστηκε με αύξηση του δείκτη αντιδραστικής υπεραιµίας (flow-mediated dilatation-FMD). Η αύξηση αυτή ήταν σημαντική και στους ασθενείς που έχουν AL αμυλοείδωση με καρδιακή συμμετοχή και επίσης σχετίστηκε με τα επίπεδα απελευθέρωσης του cGMP από τα λεία μυϊκά κύτταρα. Οι κυτταροτοξικές ελαφριές αλυσίδες οδήγησαν σε αύξηση του ER στρες και στα λεία μυϊκά κύτταρα. Έτσι και στους δύο κυτταρικούς πληθυσμούς η χρήση του αναστολέα της IRE-1a απέτρεψε την κυτταροτοξικότητα επαγόμενη από τις ελαφριές αλυσίδες. Ιn vivo, η ενδοκαρδιακή χορήγηση των τριών κυτταροτοξικών και αμυλοειδογόνων ελαφριών αλυσίδων οδήγησε σε καρδιοτοξικότητα με εμφανείς ιστολογικές αλλοιώσεις. Η κάπα ελαφριά αλυσίδα εμφάνισε καρδιοτοξικότητα με χαρακτηριστικό φαινότυπο απόπτωσης των καρδιομυοκυττάρων και διατηρημένη συσταλτική λειτουργία ενώ οι λάμδα αλυσίδες οδήγησαν σε μειωμένο κλάσμα εξώθησης, διάμεση ίνωση και αυξημένη αυτοφαγία. Κοινός μηχανισμός τοξικότητας των χορηγούμενων ελαφριών αλυσίδων αναδείχθηκε η αύξηση των δεικτών ER στρες. Το μοντέλο αμυλοειδώματος AL που περιέχει αμυλοειδή από ελαφριές αλυσίδες πλήρους μήκους από ασθενείς με AL αμυλοείδωση βρέθηκε κατάλληλο για τον χαρακτηρισμό μορίων που προσδένονται σε αμυλοειδή και η χρήση του ανέδειξε ένα από τρία υποψήφια ραδιοδιαγνωστικά ως το καλύτερο για τον εντοπισμό αμυλοειδών AL in vivo.
Συμπεράσματα: Οι ελαφριές αλυσίδες που προέρχονται από ασθενείς με AL αμυλοείδωση και καρδιακή συμμετοχή επάγουν καρδιοτοξικότητα, η οποία συσχετίζεται με το αμυλοειδογόνο δυναμικό τους και το ER στρες αποτελεί σημαντικό σηματοδοτικό μονοπάτι για την ανάπτυξη καρδιοπροστατευτικών παραγόντων. Η χρήση των ζωικών μοντέλων που αναπτύχθηκαν αναμένεται να συμβάλει στην ανάπτυξη καρδιοπροστατευτικών παραγόντων και φαρμακομορίων που στοχεύουν στο αμυλοειδές.

Θετικές Επιστήμες

Επιστήμες Υγείας

Αμυλοείδωση, ελαφριές αλυσίδες, καρδιοτοξικότητα

Ναι

4

Ναι

304

286

Δεν επιτρέπεται η πρόσβαση στο αρχείο έως 2025-12-02.

https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/object/3254963