Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Kωνσταντινος Βοργιάς, Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Ζαφειρούλα Γεωργούση, Ερευνήτρια Α’, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος»
Ουρανία Τσιτσιλώνη, Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Σπύρος Ευθυμιόπουλος, Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Διδώ Βασιλακοπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Δημήτρης Κλέτσας, Διευθυντής ερευνών ΙΒΕ, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος»
Ιωάννης Σωτηρόπουλος, Ερευνητής Γ’, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος»
Περίληψη:
Οι οπιοειδείς υποδοχείς (μ-ΟR, δ-ΟR και κ-OR) ανήκουν στην υπεροικογένεια των υποδοχέων που συζευγνύονται με τις G πρωτεΐνες (GPCRs), οι οποίοι κατανέμονται στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα και ρυθμίζουν διεργασίες που σχετίζονται με τη διάθεση και το αίσθημα ανταμοιβής. Οι κ-οπιοειδείς υποδοχείς (κ-ORs) εκφράζονται ευρέως σε όλο το κεντρικό νευρικό σύστημα και ενεργοποιούνται από ειδικά ενδογενή
οπιοειδή που προέρχονται από το γονίδιο της προδυνορφίνης και από εξωγενείς προσδέτες. Οι αγωνιστές των κ-οπιοειδών υποδοχέων προκαλούν δυσφορία, ανηδονία και καταθλιπτικές συμπεριφορές σε ανθρώπους και μοντέλα τρωκτικών ενώ οι ανταγωνιστές του κ-OR αποτρέπουν τις συμπεριφορικές αποκρίσεις που προκαλούνται από το στρες. Για το λόγο αυτό το ενδογενές σύστημα δυνορφίνης/κ-OR παίζει πολύ σημαντικό ρόλο σε διαταραχές της διάθεσης όπως ο εθισμός, το άγχος και η κατάθλιψη. Ο κ-OR προσδένεται με τις πρωτεΐνες Gi/o για να ρυθμίσει καθοδικά μόρια τελεστές όπως η αδενυλική κυκλάση, οι διαύλοι K+/Ca+2, η φωσφολιπάση C και οι ΕRK 1,2 κινάσες επηρεάζοντας έτσι την μεταγραφή γονιδίων και την κυτταρική φυσιολογία. Έχει αποδειχθεί ότι ένας αριθμός διαφορετικών GPCRs ρυθμίζει την αυτοφαγία, μέσω διαφορετικών μηχανισμών. Η αυτοφαγία αποτελεί έναν ομοιοστατικό μηχανισμό αποικοδόμησης κυτταροπλασματικού υλικού μέσω των λυσοσωμάτων και στο νευρικό κύτταρο ρυθμίζει την ανάπτυξη, τη λειτουργία των αξόνων, των δενδριτών και των συνάψεων. Ανεπαρκής ή υπερβολική αυτοφαγία στους νευρώνες συμβάλλει σε εκφυλισμό αυτών των δομών οδηγώντας σε παθολογικές αλλαγές. Η αυτοφαγία μεταβάλλει επίσης την κινητική της απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστών και την πυκνότητα των συναπτικών κυστιδίων συμβάλλοντας έτσι σε μηχανισμούς συναπτικής πλαστικότητας. Η παρούσα εργασία έχει ως πρώτο στόχο να διερευνήσει εάν η ενεργοποίηση του κ-οπιοειδούς υποδοχέα από εξειδικευμένα, εξωγενή ή ενδογενή πεπτίδια, όπως το U50,488H και η Δυνορφίνη1-13, αντίστοιχα, ρυθμίζουν τον μηχανισμό της αυτοφαγίας στους νευρώνες in vitro και in vivo. Επιπλέον, να ελέγξει τις αλλαγές που παρατηρούνται σε διάφορες συναπτοσωμικές πρωτεΐνες και στη μορφολογία των νευρώνων. Eπιπλέον ως δεύτερο στόχο έχει να προσδιορίσει το μοριακό μονοπάτι μέσω του οποίου ο ενεργοποιημένος κ-ΟR ρυθμίζει τον αυτοφαγικό μηχανισμό και να διερευνήσει τυχόν αλλαγές που προκαλούνται στην έκφραση αυτοφαγικών γονιδίων. Τέλος, με γνώμονα το γεγονός ότι, το ενδογενές σύστημα δυνορφίνης/κ-ΟR ενεργοποιείται σε καταστάσεις άγχους και κατάθλιψης ένας σημαντικός και τρίτος στόχος της μελέτης μας είναι να διερευνήσει αν το οξύ στρες ενεργοποιεί την αυτοφαγία μέσω του κ-ΟR και επηρεάζει τις συνάψεις. Τα πειραματικά δεδομένα της παρούσας διατριβής δηλώνουν ότι έκθεση νευρωνικών κυττάρων στον αγωνιστή του κ-OR, U50,488H και στο ενδογενές νευροπεπτίδιο δυνορφίνη, οδηγούν στην αύξηση κομβικών αυτοφαγικών δεικτών με δόσο- και χρόνο- εξαρτώμενο τρόπο. Η επίδραση αυτή αντιστρέφεται από επιλεκτικούς ανταγωνιστές του κ-OR. Οι πρωτεΐνες Gi/o και ERK1,2 κινασες είναι υπεύθυνες για την U50,488H-επαγόμενη αυτοφαγία. Ένα ενδιαφέρον εύρημα της μελέτης μας ήταν ότι η εξαρτώμενη από την U50,488H ενεργοποίηση του CREB ρυθμίζει τη μεταγραφή του προαυτοφαγικού γονιδίου becn1, επιβεβαιώνοντας ότι ο κ-ΟR οδηγεί σε
αύξηση της μεταγραφής συγκεκριμένων αυτοφαγικών γονιδίων. Αναστολή των ERK1,2 κινασών αποτρέπει την U50,488H-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση του CREB, δηλώντας ότι τα σημαντικότερα καθοδικά σηματοδοτικά συστατικά που συμμετέχουν στην επαγόμενη από τον κ-ΟR αυτοφαγία εκτός από τις Gi/o και ERK1,2 κινάσες περιλαμβάνουν και τον μεταγραφικό παράγοντα CREB, ο οποίος προσδένεται στον υποκινητή διαφόρων αυτοφαγικών γονιδίων. Ιn vivo πειράματα, ύστερα από χορήγηση του U50,488H, έδειξαν ότι η επαγόμενη από τον κ-ΟR αυτοφαγία εμφανίζεται μόνο στον ιπποκάμπο και όχι στο ραβδωτό και το φλοιό όπως αποδεικνύεται με τα αυξημένα επίπεδα των αυτοφαγικών δεικτών LC3-II και Beclin1. Επιπλέον, η χορήγηση U50,488H σε μύες οδήγησε στην αποικοδόμηση των βασικών συναπτικών πρωτεϊνών όπως οι σπινοφιλίνη, PSD95 και SNAP25 μόνο στον ιππόκαμπο. Οι πρωτεΐνες αυτές συμμετέχουν στην αναδιαμόρφωση και λειτουργία των δενδριτικών ακάνθων και με βάση τα ευρήματα της παρούσας μελέτης
βρέθηκε ότι αλληλεπιδρούν με την πρωτεϊνη LC3 καθώς εντοπίζονται στο εσωτερικό απομονωμένων αυτοφαγοσωμάτων. Επιπλέον, η αναστολή της αυτοφαγίας δεν οδήγησε σε μείωση των συναπτοσωμικών πρωτεϊνών συμπεραίνοντας ότι η αποικοδόμηση αυτών των πρωτεϊνών οφείλεται στην εσωτερίκευσή τους στα αυτοφαγοσώματα. Πρωτογενείς καλλιέργειες νευρώνων έδειξαν επίσης ότι η ενεργοποίηση του κ-ΟR μειώνει τον αριθμό
των διακλαδώσεων των νευριτών στον ιππόκαμπο αποδεικνυώντας ότι η ενεργοποίηση της αυτοφαγίας επηρεάζει άμεσα την μορφολογία των νευρώνων. Ένα άλλο ενδιαφέρον αποτέλεσμα της παρούσας μελέτης ήταν ότι η εξαναγκασμένη κολύμβηση (FST) σε μύες οδήγησε στην επαγωγή της αυτοφαγίας. Η επίδραση αυτή αναστέλλεται με τη χορήγηση του ειδικού ανταγωνιστή του κ-OR, nor-BNI. Τέλος, ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός
ότι η χορήγηση του nor-BNI σε μύες σε καταστάσεις στρες, οδηγεί στην μείωση της σπινοφιλίνης, της PSD-95 και της SNAP-25, στον ιππόκαμπο αλλά όχι στον φλοιό των ζώων που υποβλήθηκαν σε στρες. Τα αποτελέσματα αυτά δηλώνουν ότι κάτω από συνθήκες οξέος στρες, η απελευθέρωση της δυνορφίνης ενεργοποιεί τον αυτοφαγικό μηχανισμό που οδηγεί σε συναπτοσωμικές μεταβολές στον ιππόκαμπο. Η ταχέως αναπτυσσόμενη βιβλιογραφία σχετικά με την λειτουργία του κ-OR εστιάζει το ενδιαφέρον της στην ανάπτυξη ανταγωνιστών του υποδοχέα για νέες θεραπευτικές αγωγές για την κατάθλιψη και τις αγχώδεις διαταραχές, καθώς και για τη ρύθμιση του στρες και τη μείωση της δυσφορίας σε καταστάσεις εθισμού. Τα αποτελέσματα μας παρουσιάζουν ένα νέο σηματοδοτικό μονοπάτι του κ-OR, όπου οι επιλεκτικοί προσδέτες του μπορούν να ρυθμίζουν την αυτοφαγία και να προκαλούν αλλαγές στις συνάψεις σε καταστάσεις οξέος στρες. Τα ευρήματα αυτά μπορούν επίσης να εξηγήσουν τον τρόπο δράσης των ειδικών
κ-οπιοειδών ανταγωνιστών που βρίσκονται σήμερα σε κλινικές δοκιμές φάσης ΙΙI για τη θεραπεία νευροψυχιατρικών διαταραχών λόγω του στρες. Τα αποτελέσματα της παρούσης διατριβής θα διευρύνουν την υφιστάμενη γνώση που υπάρχει σε σχέση με την λειτουργικότητα και το ρόλο που παίζει ο κ-OR σε θέματα που αφορούν αλλαγές στην νευρωνική πλαστικότητα και θα βοηθήσει στον προσδιορισμό νέων φαρμακολογικών παραγόντων και στόχων για την καταπολέμηση των νευροψυχιατρικών παθήσεων που σχετίζονται με το άγχος και την κατάθλιψη.
Λέξεις-κλειδιά:
οπιοειδή, υποδοχέας, αυτοφαγία, άγχος, συναπτοσωμικές πρωτεϊνες, G πρωτεϊνες, κ-οπιοειδής υποδοχέας
