Περίληψη:
Το Helicobacter pylori είναι ένα Gram αρνητικό βακτήριο το οποίο αποικίζει τον
ανθρώπινο γαστρικό βλεννογόνο, με επιπολασμό που ξεπερνά το 50% παγκοσμίως. Το
επίμονο αυτό παθογόνο μπορεί να προκαλέσει ποικίλες βλάβες, από μια χρόνια
εμμένουσα γαστρίτιδα έως δωδεκαδακτυλικό έλκος και γαστρικό καρκίνο. Η
ποικιλομορφία των κλινικών εκδηλώσεων της λοίμωξης εξαρτάται από παράγοντες που
άπτονται, αφενός, της βακτηριακής ποικιλομορφίας και, αφετέρου, της
ανοσολογικής απόκρισης συνεπεία της γενετικής ποικιλομορφίας του ξενιστή καθώς
επίσης και των περιβαλλοντικών παραγόντων, οι οποίοι αναπόφευκτα επηρεάζουν την
αλληλεπίδραση των στοιχείων του ξενιστή και του βακτηρίου. Ένας εκ των πιο
σημαντικών βακτηριακών παραγόντων παθογένειας είναι η πρωτεΐνη CagA
(Cytotoxin-associated gene A) η οποία έχει χαρακτηριστεί ως ογκοπρωτεΐνη
βακτηριακής φύσεως. Το Η. pylori εγχέει την CagA εντός των γαστρικών
επιθηλιακών κυττάρων του ξενιστή, μέσω ενός συστήματος έκκρισης τύπου IV
(T4SS), συμβάλλοντας στην απορρύθμιση οδών μεταγωγής σήματος που σχετίζονται,
μεταξύ άλλων, με την κυτταρική πολικότητα, τη φλεγμονή, και τον καρκίνο.
Καθοριστικό ρόλο στη δράση της, παίζουν τα επαναλαμβανόμενα μοτίβα EPIYA
(Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala: γλουταμικό οξύ-προλίνη-ισολευκίνη-τυροσίνη-αλανίνη) στο
καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης, τα οποία αποτελούν θέσεις αναγνώρισης και
φωσφορυλίωσης της τυροσίνης (Y).
Στην παρούσα διπλωματική εργασία αξιολογήθηκαν στελέχη H. pylori που εξέφραζαν
την πρωτεΐνη CagA με μεταβαλλόμενο αριθμό θέσεων φωσφορυλίωσης EPIYA και
αντίστοιχων μη φωσφορυλιώσιμων θέσεων EPIFA, σημασμένων στο καρβοξυτελικό άκρο
με εξαπεπτίδιο της μορφής Cys–Cys–Pro–Gly–Cys–Cys για την επίτευξη σήμανσης με
τον φθορίζοντα παράγοντα FlAsH. Απώτερος σκοπός ήταν η διερεύνηση της
συμμετοχής της βακτηριακής πρωτεΐνης CagA, και των φωσφορυλιώσιμων μοτίβων
EPIYA-C της πρωτεΐνης, στην έκκριση Ιντερλευκίνης 8 (IL-8) από τα μολυσμένα
γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα της κυτταρικής σειράς AGS, μέσω ενεργοποίησης του
μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ.
Έγινε μόλυνση, in vitro, κυττάρων AGS με μια σειρά από ισογονιδιακά
μεταλλάγματα Η. pylori του στελέχους αναφοράς P12, που εξέφραζαν την πρωτεΐνη
CagA με διαφορετικό αριθμό φωσφορυλιώσιμων, ή μη-, θέσεων EPIYA. Όλα τα στελέχη
προηγουμένως είχαν αξιολογηθεί αναφορικά με την ικανότητά προσκόλλησης τους στα
κύτταρα AGS, τον σχηματισμό συζευκτικού διαύλου μεταφοράς (pilus) και, τέλος,
την ικανότητα τους να μεταφέρουν την πρωτεΐνη CagA εντός των κυττάρων AGS.
Δεδομένης της τροποποιητικής δράσης της CagA στην κυτταρική μορφολογία και τη
διάρρηξη των διακυτταρικών συνδέσμων, αξιολογήθηκε ο βαθμός επαγωγής του
κυτταρικού φαινοτύπου "διασποράς και επιμήκυνσης" στα εν λόγω κύτταρα. Ακόμη,
μετρήθηκαν και αξιολογήθηκαν τα επίπεδα εκκρινόμενης IL-8, μετά από 24ωρη
μόλυνση των κυττάρων AGS με όλα τα στελέχη, και διερευνήθηκε η συμμετοχή της
CagA στην επαγωγή IL-8, μέσω του μονοπατιού του NF-κΒ.
Στα αποτελέσματα της παρούσης εργασίας φάνηκε ο σημαντικός ρόλος της
φωσφορυλιωμένης πρωτεΐνης CagA (CagAPY) στην επαγωγή κυτταροσκελετικών αλλαγών
και την εμφάνιση του φαινοτύπου "διασποράς και επιμήκυνσης", σε συνάρτηση με
τον αριθμό των επαναλήψεων EPIYA. Ακόμη, σχετικά με την επαγωγή έκκρισης IL-8,
επιβεβαιώθηκε η ανάγκη ύπαρξης ενός λειτουργικού T4SS και η επιτυχής μεταφορά
της πρωτεΐνης CagA εντός των κυττάρων AGS, ανεξάρτητα του αριθμού επαναλήψεων
των μοτίβων EPIYA. Τα ευρήματα αυτά συμφωνούν με πολλές βιβλιογραφικές αναφορές
και επισημαίνουν την πολυπαραγοντική φύση των αλληλεπιδράσεων βακτηρίου-
ξενιστή. Τέλος, στην ανάλυση εικόνων της συνεστιακής μικροσκοπίας, μετά τη
μόλυνση κυττάρων AGS με τα εν λόγω στελέχη Η. pylori που βάφτηκαν με χρώση
CFDA-SE, ή σημάνθηκαν με FlAsH, η CagA εντοπίστηκε τόσο στην επιφάνεια των
κυτταρικών μεμβρανών, όσο και εντός των κυττάρων AGS. Η επιτυχής εφαρμογή της
τεχνικής σήμανσης με FlAsH θα αποτελέσει σημαντικό εργαλείο για περαιτέρω
έλεγχο του ενδοκυττάριου εντοπισμού της CagA, και της πορείας υποβάθμισης και
αποικοδόμησής της, με τη χρήση της Συνεστιακής Μικροσκοπίας και Μικροσκοπίας
αληθινού χρόνου.
Λέξεις-κλειδιά:
H. pylori, CagA, NF-κΒ, IL-8, Γαστρικός Καρκίνος
