Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Χρήστος Κρούπης, Επίκουρος Καθηγητής Κλινικής Βιοχημείας-Μοριακής Διαγνωστικής, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών
Περίληψη:
Εισαγωγή: Η ενδοθηλιακή δυστροφία του κερατοειδούς του Fuchs (FECD, Fuchs endothelial corneal dystrophy) αποτελεί μία προοδευτικά εξελισσόμενη, κληρονομική, αμφοτερόπλευρη διαταραχή του ενδοθηλίου του κερατοειδούς. Χαρακτηρίζεται από την απώλεια ενδοθηλιακών κυττάρων, την πάχυνση της μεμβράνης Descemet, το σχηματισμό εστιακών εναποθέσεων που ονομάζονται guttae ενώ στο τελικό στάδιο παρουσιάζεται οίδημα στον κερατοειδή και σχηματίζονται επιθηλιακές φυσαλίδες με συνέπεια τη σημαντική μείωση της οπτικής οξύτητας, η οποία μπορεί να οδηγήσει ακόμα και σε τύφλωση. Για το τελικό στάδιο της νόσου, η μεταμόσχευση κερατοειδούς ή η κερατοπλαστική αποτελεί τη μοναδική οριστική θεραπεία. Ο επιπολασμός της FECD ποικίλλει σημαντικά σε ολόκληρο τον κόσμο.
Η FECD είναι μια γενετικά ετερογενής ασθένεια. Υπάρχουν δύο μορφές που καθορίζονται από την ηλικία έναρξης. Η FECD σε πρώιμο στάδιο η οποία είναι σπάνια και η πιο συχνή FECD όψιμης έναρξης που μπορεί να είναι είτε οικογενής είτε σποραδική με εμφάνιση συνήθως μετά την ηλικία των 50 ετών. Η FECD πρώιμης έναρξης σχετίζεται με μεταλλάξεις στο COL8A2 γονίδιο Περαιτέρω, για την όψιμη έναρξης FECD έχει ταυτοποιηθεί ένας πολυμορφισμός g.97923C>A dbSNPrs613872, στο ιντρόνιο 3 του γονιδίου του μεταγραφικού παράγοντα 4 (TCF4) που κωδικοποιεί ένα μέλος της οικογένειας Ε-πρωτεϊνών (Ε2-2) ο οποίος συσχετίζεται σημαντικά με το FECD, και αυξάνοντας την πιθανότητα εμφάνισης FECD κατά 30 φορές σε ομόζυγα άτομα.
Μέθοδοι: Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη νέας μεθοδολογίας real-time PCR και ανάλυση καμπυλών τήξης για τη γονοτύπηση του πολυμορφισμού rs613872 στο γονίδιο TCF4 και η εφαρμογή της σε δείγμα 22 Ελλήνων ασθενών με FECD (κριτήριο Krachmer ≥2 και 58 υγιών μαρτύρων, με ανάλογη κατανομή σε φύλο και ηλικία, στους οποίους απομονώθηκε DNA από περιφερικό αίμα, επιλεγμένων κατόπιν έγγραφης συγκατάθεσης, οφθαλμολογικής εξέτασης και συλλογής κλινικών δεδομένων. Επίσης με τη μέθοδο DNA Sequencing κατά Sanger σαρώθηκε γενωμική περιοχή του COL8A2 γονιδίου για την ανίχνευση των μεταλλάξεων g.31753T>G L450W rs8035192 και g.31767C>A Q455K rs8035191. Χρησιμοποιήθηκαν τα υπολογιστικά προγράμματα SNPStats και SPSS για τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων.
Αποτελέσματα: Αναπτύχθηκε ταχεία και αξιόπιστη μεθοδολογία για τον πολυμορφισμό rs613872 του TCF4 γονιδίου με τη χρήση δύο ανιχνευτών υβριδισμού για τη συμπληρωματική αλυσίδα στο όργανο LightCycler (Roche) και συλλέχθηκαν στοιχεία αναλυτικής επικύρωσης, (απόδοση Ε=1,89, CV αναπαραγωγιμότητα Cq ≤1,2%, Tm T αλληλίου 57,200C και G αλληλίου 63,750C CV=1,7% και CV=1,25% αντίστοιχα, ΔTm=7,39). Τα αποτελέσματα γονοτύπησης επιβεβαιώθηκαν 100% και με τη μέθοδο αναφοράς DNA Sequencing. Παρατηρήθηκε αύξηση του G αλληλίου από 17,24% στους υγιείς σε 47,73% στους ασθενείς και στατιστικά σημαντική συσχέτιση με το νόσημα με OR 4,82 (CI 1,98-11,73 log-additive μοντέλο). Συσχέτιση του αλληλίου κινδύνου με την ηλικία και το φύλο, δε διαπιστώθηκε στα υπό εξέταση δείγματα. Με τη σάρωση DNA Sequencing κατά Sanger στο COL8A2 γονίδιο για την ανίχνευση των μεταλλάξεων L450W και Q455K δεν διαπιστώθηκε η ύπαρξη αυτών των μεταλλάξεων στα υπό εξέταση δείγματα και ανιχνεύθηκε σε 1 δείγμα ένας νεοαναφερόμενος πολυμορφισμός NM_005202.3:c1491G>A→p.A497T.
Συμπεράσματα: Από τα παραπάνω προκύπτει ότι ο πολυμορφισμός rs613872 του TCF4 γονιδίου συσχετίζεται στατιστικά σημαντικά με την FECD όψιμης έναρξης στον ελληνικό πληθυσμό, ενώ οι μεταλλάξεις L450W και Q455K στο γονίδιο COL8A2 δεν σχετίζονται.
Λέξεις-κλειδιά:
Δυστροφία κερατοειδούς, Fuchs, TCF4, COL8A2,
