Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Αθηνά Λινού-Παπαδημητρίου, Καθηγήτρια, Ιατρική, Ε.Κ.Π.Α.
Γεώργιος Ζωγράφος, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, Ε.Κ.Π.Α.
Σοφία Τσελένη-Μπαλαφούτα, Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, Ε.Κ.Π.Α.
Δημήτριος Λινός, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, Ε.Κ.Π.Α.
Γεώργιος Μαστοράκος, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, Ε.Κ.Π.Α.
Νικόλαος Αρκαδόπουλος, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, Ε.Κ.Π.Α.
Νικόλαος Δανιάς, Επίκουρος Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, Ε.Κ.Π.Α.
Περίληψη:
Η παθολογία του θυρεοειδούς αποτελεί ένα συχνά απαντώμενο και δαπανηρό πρόβλημα υγείας που απαιτεί σαφή διαγνωστική προσέγγιση και ορθή αντιμετώπιση. Καθώς νέα δεδομένα προκύπτουν διαρκώς, δημιουργείται η δυνατότητα για βελτιωμένα πρωτόκολλα διάγνωσης, κατηγοριοποίησης και διαχείρισης των ασθενών. Η αποσαφήνιση μοριακών και βιολογικών μηχανισμών των νόσων είναι σημαντική στο καθορισμό χρήσιμων προγνωστικών δεικτών στους ασθενείς και ιδιαίτερα σε εκείνους υψηλού κινδύνου. Μέχρι σήμερα δεν υπάρχει τρόπος μη παρεμβατικής διάγνωσης και παρακολούθησης του καρκίνου του θυρεοειδούς αδένα. Τα microRNAs (miRNAs) είναι ενδογενή μονόκλωνα μόρια RNA που η αλυσίδα τους αποτελείται από περίπου 22 νουκλεοτίδια, τα οποία δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Δρουν στο προ-μεταγραφικό επίπεδο και ρυθμίζουν αρνητικά τους στόχους τους ανάλογα με το βαθμό συμπληρωματικότητας ανάμεσα στο miRNA και το γονίδιο στόχο.
Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι να συμβάλλει στη δημιουργία νέων εργαλείων για ακριβή και μη επεμβατική διάγνωση του καρκίνου του θυρεοειδούς αδένα.
Για την εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής, συλλέχθηκαν μονιμοποιημένα σε παραφίνη ιστολογικά δείγματα θυρεοειδούς, ήτοι 35 δείγματα από θηλώδες καρκίνωμα και ισάριθμα δείγματα από παρακείμενο φυσιολογικό θυρεοειδή αδένα. Σε 16 από τους 35 αυτούς ασθενείς, κατέστη δυνατή η συλλογή προεγχειρητικού ορού αίματος. Επίσης, συλλέχθηκαν προεγχειρητικοί οροί αίματος επιπλέον από 48 ασθενείς με θηλώδες καρκίνωμα θυρεοειδούς, καθώς και από 72 ασθενείς με άλλες παθήσεις του θυρεοειδούς αδένα (π.χ. από άτομα με καλοήθεια στο θυρεοειδή, με υπερπαραθυρεοειδισμό κλπ.). Έγινε ομογενοποίηση ιστολογικών δειγμάτων θυρεοειδούς αδένα και απομόνωση ολικού RNA από τα ομογενοποιημένα δείγματα και από ορό αίματος. Ακολούθησε προσδιορισμός της συγκέντρωσης και έλεγχος της καθαρότητας και ακεραιότητας του απομονωμένου ολικού RNA. Στη συνέχεια, έγινε αλληλούχηση RNA κατόπιν εμπλουτισμού για τα miRNAs. Έλαβε χώρα πολυαδενυλίωση ολικού RNA και αντίστροφη μεταγραφή του σε μονόκλωνο
cDNA, και ποσοτική real-time PCR. Τέλος, έγινε βιοστατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων της ποσοτικής real-time PCR.
Βρέθηκε ότι δέκα πιο συχνά μεταβαλλόμενα ως προς την έκφρασή τους miRNAs είναι τα εξής: miR-125a-5p, miR-144-3p, miR-622, miR-361-5p, miR-146a-3p, miR-340-5p, miR-199a-5p, miR-205-5p, miR-335 και miR-129-5p. Τα επίπεδα των παραπάνω miRNAs διέφεραν στατιστικώς σημαντικά ανάμεσα σε καρκινικούς και φυσιολογικούς ιστούς θυρεοειδούς. Στη συνέχεια, με τις αναπτυχθείσες μεθοδολογίες real-time PCR, ποσοτικοποιήθηκε η έκφραση των δέκα αυτών miRNAs, πρώτα στους οκτώ επιλεγμένους ιστούς (ήτοι στα 4 ζεύγη) και στη συνέχεια σε ακόμα 31 ζεύγη. Από τα δέκα αυτά miRNAs, οκτώ (ήτοι όλα πλην των miR-125a-5p και miR-205-5p) παρουσίασαν στατιστική σημαντικότητα ως προς τις διαφορές μεταξύ καρκινικών και αντίστοιχων φυσιολογικών δειγμάτων. Επίσης, βρέθηκε ότι η υψηλή έκφραση των miR-144-3p, miR-146a-3p και miR-340-5p, καθώς και η χαμηλή έκφραση των miR-622, miR-361-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p και miR-129-5p, συσχετίζεται με συγκεκριμένα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά, όπως με ύπαρξη λεμφαδενικών μεταστάσεων, εξωκαψική διήθηση και πολυεστιακότητα των καρκινικών όγκων του θυρεοειδούς αδένα. Τα επίπεδα πέντε εκ των παραπάνω οκτώ miRNAs διέφεραν στατιστικώς σημαντικά ανάμεσα σε ορούς αίματος από ασθενείς με θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς αδένα και σε λοιπούς ασθενείς. Τα miRNAs αυτά ήταν τα εξής: miR-144-3p, miR-146a-3p, miR-340-5p, miR-199a-5p και miR-335. Επίσης, με βιοστατιστική ανάλυση η οποία περιελάμβανε την κατασκευή καμπυλών ROC, καθώς και μονομεταβλητή λογιστική ανάλυση παλινδρόμησης, φάνηκε ότι μπορούν να διακρίνουν τους μεν από τους δε ασθενείς. Η δε πολυμεταβλητή λογιστική ανάλυση παλινδρόμησης έδειξε ότι τα πέντε αυτά miRNAs μπορούν να χρησιμοποιηθούν συνδυαστικά για τη (διαφορο)διάγνωση θηλώδους καρκινώματος του θυρεοειδούς αδένα. Tα επίπεδα των πέντε επιλεγμένων miRNA (ήτοι: miR-144-3p, miR-146a-3p, miR-340-5p, miR-199a-5p και miR-335) στο αίμα συσχετίζονται στατιστικώς σημαντικά με συγκεκριμένα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των καρκινοπαθών.
Συμπερασματικά, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής, μια «μοριακή υπογραφή» αποτελούμενη από τα miR144-3p, miR-146a-3p, miR-340-5p, miR-199a-5p και miR-335 είναι ικανή να διαγνώσει με μεγάλη ακρίβεια και ευαισθησία το θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς, από δείγμα αίματος. Άτομα με διαταραγμένα επίπεδα τεσσάρων (ή πέντε) από τα παραπάνω πέντε miRNAs έχουν πολλαπλάσια πιθανότητα να διαγνωσθούν με θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς αδένα, σε σχέση με τον υπόλοιπο πληθυσμό. Η διαφοροδιαγνωστική ικανότητα αυτής της «μοριακής υπογραφής» είναι ανεξάρτητη. Τέλος, η διαταραχή των επιπέδων των πέντε αυτών miRNAs σχετίζεται με κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά του θηλώδους καρκινώματος του θυρεοειδούς αδένα.
Λέξεις-κλειδιά:
Θυρεοειδής αδένας, mi-RNAs, real-time PCR, Αλληλούχιση νέας γενιάς, Θηλώδης καρκίνος θυρεοειδούς αδένα
