Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Ουρανία Τσιτσιλώνη, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια
Τομέας Φυσιολογίας Ζώων και Ανθρώπου, Τμήμα Βιολογίας
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Περίληψη:
Το Πολλαπλούν Μυέλωμα (ΠΜ) είναι μια ανίατη κακοήθεια που χαρακτηρίζεται από τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό παθολογικών πλασματοκυττάρων τα οποία διηθούν το μυελό των οστών και παράγουν περίσσεια μονοκλωνικής ανοσοσφαιρίνης. Τα νέα θεραπευτικά πρωτόκολλα που περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, τη χρήση αναστολέων του πρωτεασώματος και ανοσοτροποποιητών επιτρέπουν την επίτευξη συμβατικής πλήρους απόκρισης (CR) στην πλειονότητα των ασθενών με ΠΜ. Ωστόσο, συχνά πολλοί ασθενείς υποτροπιάζουν μετά από τη θεραπεία. Για το λόγο αυτό, έχει ενοχοποιηθεί και το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών, το οποίο πιθανά δρα υποστηρικτικά συμβάλλοντας στην κλωνική επέκταση των μυελωματικών πλασματοκυττάρων. Πρόσφατες μελέτες της παθοφυσιολογίας του ΠΜ υποδεικνύουν την πιθανή συμμετοχή δύο ανοσοκατασταλτικών πληθυσμών, των TH17 λεμφοκυττάρων και των κατασταλτικών κυττάρων μυελοειδούς προέλευσης (MDSCs), τα οποία εμφανίζουν αυξημένα ποσοστά στο μυελό των οστών των ασθενών με ΠΜ. Παραδόξως, η μελέτη των ρυθμιστικών Τ λεμφοκυττάρων, τα οποία επίσης χαρακτηρίζονται από ισχυρή ανοσοκατασταλτική δραστικότητα, δεν έχει καταδείξει σαφή συσχέτιση των συγκεκριμένων κυττάρων στην εμφάνιση και πρόοδο της νόσου. Σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας ήταν η ανάπτυξη μεθόδου Πολυχρωματικής Κυτταρομετρίας Ροής (ΠΚΡ) για τη μελέτη των επιπέδων και της λειτουργικότητας των Tregs στο μυελό των οστών και στο περιφερικό αίμα ασθενών με ΠΜ στους οποίους, μετά από θεραπεία, ανιχνεύουμε ελάχιστη υπολειπόμενη νόσο (ΕΥΝ+) ή όχι (ΕΥΝ-) στο μυελό των οστών τους. Για τις ανάγκες της συγκεκριμένης εργασίας έγινε φαινοτυπική ανάλυση των Tregs σε δείγματα περιφερικού αίματος και μυελού των οστών από 27 ασθενείς με ΠΜ. Τα δείγματα συλλέχθηκαν από την Αιματολογική-Ογκολογική Κλινική της Ιατρικής Σχολής του ΕΚΠΑ, Γ.Ν.Α. «Αλεξάνδρα». Για την πραγματοποίηση της φαινοτυπικής ανάλυσης των Tregs με ΠΚΡ τα δείγματα και των δύο βιολογικών υλικών σημάνθηκαν με 12 φθορίζοντα αντισώματα χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικούς συνδυασμούς οκταχρωμίας: CD3-FITC, CD4-APC/Cy7, CD25-APC, FoxP3-PE, CD8-PerCP/Cy5-5, Ki67-AmCyan, CD45RA-PE/Cy7, CD39-Pacific Blue, CD45RO-PerCP/Cy5-5, CTLA-4-Pacific Blue, CD127-AmCyan, HLADR-PE/Cy7. Παράλληλα με τη φαινοτυπική ανάλυση των Tregs, στα δείγματα μυελού των οστών και περιφερικού αίματος νεοδιαγνωσθέντων ασθενών έγινε ταυτοποίηση του υποτύπου της παραπρωτεΐνης, όπου αυτό ήταν εφικτό, ενώ οι ασθενείς που βρίσκονταν σε πλήρη κλινική ύφεση μετά από θεραπεία, κατηγοριοποιήθηκαν ανάλογα με την εμφάνιση ή όχι ΕΥΝ στα δείγματα μυελού των οστών με τη χρήση ΠΚΡ. Με βάση τα παραπάνω έγινε (%) ποσοτικός προσδιορισμός των επιπέδων των Tregs και μελέτη της λειτουργικότητάς τους ξεχωριστά σε τρεις ομάδες ασθενών: α) νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς, β) ΕΥΝ+ ασθενείς και γ) ΕΥΝ- ασθενείς. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, τα Tregs υπερέχουν αριθμητικά στο περιφερικό αίμα συγκριτικά με το μυελό των οστών και στις τρεις ομάδες ασθενών (νεοδιαγνωσθέντες, ΕΥΝ+, ΕΥΝ-) που εξετάσαμε, ενώ οι EYN- ασθενείς εμφάνισαν τα υψηλότερα ποσοστά CD3+CD4+CD25hiFoxP3+ Tregs και CD3+CD4+CD25hiFoxP3+CD127lo Tregs τόσο στο σύνολο των CD4+ T λεμφοκυττάρων όσο και στο σύνολο των εμπύρηνων κυττάρων για κάθε αναλυθέν δείγμα. Παράλληλα, οι νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς χαρακτηρίζονταν από υψηλότερα ποσοστά Tregs επί των CD4+ T λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα σε σχέση με το μυελό των οστών, ενώ στους ΕΥΝ+ και ΕΥΝ- παρατηρήθηκε η αντίστροφη εικόνα. Όσον αφορά τη μελέτη του λειτουργικού προφίλ των CD3+CD4+CD25hiFoxP3+ Tregs, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην έκφραση των αντιγονικών δεικτών που μελετήσαμε μεταξύ μυελού των οστών και περιφερικού αίματος ανά ομάδα ασθενών, ωστόσο οι EYN+ ασθενείς εμφάνισαν υψηλότερα ποσοστά CD39+ Tregs. Τα παραπάνω αποτελέσματα αποτελούν μια πρώτη ένδειξη ότι τα Tregs των EYN+ ασθενών πιθανά εμφανίζουν ισχυρότερα ανοσοκατασταλτικό φαινότυπο, διευκολύνοντας την ανοσοδιαφυγή των μυελωματικών κυττάρων, παρά το γεγονός ότι σε απόλυτους αριθμούς δεν παρουσιάζουν αριθμητική αύξηση. Ακόμη, είναι πιθανό οι φαρμακευτικοί παράγοντες που χρησιμοποιούνται στα θεραπευτικά πρωτόκολλα να μεταβάλλουν άμεσα ή έμμεσα το πρότυπο μετανάστευσης και αγκυροβόλησης των Tregs από το περιφερικό αίμα προς το μυελό των οστών ή αντίστροφα. Παρόλα αυτά, απαιτείται ανάλυση περισσότερων δειγμάτων για την αποσαφήνιση του ρόλου των Tregs στην παθοφυσιολογία του ΠΜ.
