Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Γαϊτανάκη Αικατερίνη, Καθηγήτρια Φυσιολογίας Ζώων, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιαστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Γεωργοπούλου Ουρανία, Υπεύθυνη Εργαστηρίου Μοριακής Ιολογίας, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ
Παπαζαφείρη Παναγιώτα, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Φυσιολογίας Ζώων, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιαστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Περίληψη:
Η ηπατίτιδα C είναι ιογενής νόσος που προσβάλλει κυρίως το ήπαρ και οφείλεται στον ιό της ηπατίτιδας C (Hepatitis C virus, HCV). Υπολογίζεται ότι σήμερα το 3% περίπου του παγκόσμιου πληθυσμού έχει εκτεθεί στον HCV ιό. Μέχρι σήμερα έχουν σημειωθεί πάνω από 300.000 θάνατοι που οφείλονται στον HCV ιό, οι περισσότεροι λόγω κίρρωσης και ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (ΗΚΚ). Παράλληλα, οι ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα C ανέρχονται σε πάνω από 170 εκατομύρια και αποτελούν ομάδα υψηλού κινδύνου για ανάπτυξη κίρρωσης και ΗΚΚ. Στατιστικά, μετά την αρχική μόλυνση με τον HCV, 75-85% των ασθενών αναπτύσσει χρόνια νόσο. Από τους ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα C, το 20-30% αναπτύσσουν κίρρωση μετά από 20-25 χρόνια από την αρχική μόλυνση. Τέλος, από τους ασθενείς με κίρρωση που σχετίζεται με τον HCV, το 2-7% αναπτύσσει ΗΚΚ. Ο HCV ανήκει στο γένος Hepacivirus της οικογένειας Flaviviridae. Το ιικό σωματίδιο αποτελείται από ένα μονόκλωνο, θετικής πολικότητας μόριο RNA μήκους 10 Kb περίπου, που περιβάλλεται από ένα πρωτεϊνικής σύστασης περίβλημα με εικοσαεδρική (σφαιρική), το καψίδιο. Το γονιδίωμα του HCV κωδικοποιεί μια πολυπρωτεΐνη μήκους 3000 αμινοξέων. Το γονιδίωμα περιλαμβάνει ένα ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (open reading frame, ORF) το οποίο μεταφράζεται μέσω μιας εσωτερικής θέσης πρόσδεσης ριβοσώματος (internal ribosome entry site, IRES) στο 5’ άκρο, και περιβάλλεται από τις 5’ και 3’ μη μεταφραζόμενες περιοχές (untranslated regions, UTRs). Η πολυπρωτεΐνη που προκύπτει στη συνέχεια ωριμάζει μέσω πρωτεολύσεων και παράγονται οι δομικές πρωτεΐνες, δηλαδή οι core, Ε1 και Ε2, και οι μη δομικές πρωτεΐνες, δηλαδή οι p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A και NS5B. Η πρωτεΐνη LSD1 (Lysine-specific demethylase 1, επίσης KDM1A, AOF2, BHC110, KIA0601), είναι ένα πυρηνικό ένζυμο, το οποίο καταλύει την απομάκρυνση μεθυλομάδων από ιστονικά και μη ιστονικά κατάλοιπα λυσίνης, επηρεάζοντας έτσι την έκφραση μορίων που ρυθμίζουν σημαντικές λειτουργίες του κυττάρου. Υπάρχουν διάφορες έρευνες που δείχνουν ότι η LSD1 διαθέτει ενεργό ρόλο σε πολλές ιικές διεργασίες όπως ιική λοίμωξη, έκφραση ιικών πρωτεϊνών, καθώς και μετάβαση στη λανθάνουσα κατάσταση. Οι ιοί με σκοπό να υποστηρίξουν τον πολλαπλασιασμό τους χρησιμοποιούν εξ ολοκλήρου τον επιγενετικό μηχανισμό των κυττάρων-ξενιστών. Ταυτόχρονα, η LSD1 υπερεκφράζεται σε ιστούς ΗΚΚ και τα επίπεδα έκφρασής της είναι ευθέως ανάλογα με το στάδιο του όγκου. Γνωρίζουμε επίσης πόσο σημαντικό ρόλο παίζει ο λιπιδικός μεταβολισμός στον αναδιπλασιασμό του HCV ιού στα ηπατοκύτταρα και ότι η LSD1είναι από τους κύριους ρυθμιστές του μεταβολισμού της ενέργειας των κυττάρων. Με βάση όλα τα παραπάνω, στην παρούσα εργασία κατασκευάσαμε κυτταροσειρές Huh7.5 και HepG2 που να υπερεκφράζουν την LSD1, με χρήση πλασμιδιακού φορέα έκφρασης που να φέρει το γονίδιο της LSD1. Στη συνέχεια, μολύναμε με τους γονότυπους HCV-JFH1 και HCV-3a κλώνους Huh7.5 που υπερεκφράζουν την LSD1 με σκοπό να παρατηρήσουμε πώς επιδρά η υπερέκφραση της LSD1 στον αναδιπλασιασμό του ιού, σε σχέση με μολυσμένα κύτταρα Huh7.5. Παράλληλα, μελετήσαμε τη μεταβολή των επιπέδων της LSD1 κατά τη μόλυνση κυττάρων Huh7.5 με τους HCV-JFH1 και HCV-3a γονότυπους. Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση της LSD1, μετά τη λοίμωξη με τους δύο γονότυπους, αυξάνεται στις πρώτες 48 ώρες και μετά επανέρχεται στα φυσιολογικά επίπεδα. Παρατηρήσαμε επίσης, ότι όταν ο γονότυπος HCV-JFH1 μολύνει κυτταρικό κλώνο που υπερεκφράζει την LSD1, η κορύφωση του ιικού πολλαπλασιασμού ήταν 14 φορές υψηλότερη σε σχέση με τις καλλιέργειες-μάρτυρες, ενώ υπήρχε καθυστέρηση στο ρυθμό του ιικού πολλαπλασιασμού από τις 48 στις 72 ώρες. Αντιθέτως, ο γονότυπος HCV-3α παρουσιάζει αυξημένο αναδιπλασιασμό στον κλώνο Hu1b σε σχέση με τους μάρτυρες, κατά τις 24 πρώτες ώρες της μόλυνσης. Στη συνέχεια όμως, παρατηρείται σημαντική παρεμπόδιση του ρυθμού ιικού πολλαπλασιασμού, ο οποίος σχεδόν μηδενίζεται στις 48 ώρες και ανακάμπτει σε μικρό βαθμό μέχρι το τέλος της μόλυνσης. Υπάρχουν στη βιβλιογραφία μελέτες που αναδεικνύουν το ρόλο της LSD1 σε ιικές λοιμώξεις. Σε κάποιες αναφέρεται ως εργαλείο που χρησιμοποιεί ο ιός για να επιβιώσει και σε άλλες αναφέρεται ως εργαλείο άμυνας του οργανισμού. Μέχρι στιγμής δεν υπάρχουν αρκετά δεδομένα που να αποσαφηνίζουν αλληλεπίδραση μεταξύ LSD1 και HCV ιού. Το παραπάνω πείραμα έχει ανοίξει νέους δρόμους για την καλύτερη κατανόηση της αλληλεπίδρασης του HCV ιού με το κύτταρο-ξενιστή, η οποία μπορεί να αποτελέσει στο μέλλον πολύτιμο εργαλείο για μια καλύτερη αντιιική θεραπεία που να στοχεύει την LSD1 για την αντιμετώπιση της ηπατίτιδας C και του ΗΚΚ.
Λέξεις-κλειδιά:
μοριακή ιολογία, ηπατίτιδα C, επιγενετικός παράγοντας, LSD1, ιός της ηπατίτιδας C HCV
