Περίληψη:
Εισαγωγή: Το ένζυμο ΑΤΡ συνθάση, κατά τη φάση της ισχαιμίας του μυοκαρδίου, αναστρέφει τη λειτουργία του και θέτει σε κίνδυνο την επιβίωση του καρδιομυοκυττάρου, καταναλώνοντας ΑΤΡ. In vitro μελέτες έδειξαν ότι διάφορες ενώσεις, μπορούν να αναστείλουν την υδρολυτική δράση του ενζύμου. Ακόμη, έχει φανεί ότι η αναστολή του στη φάση αυτή, οδηγεί σε καρδιοπροστατευτικό αποτέλεσμα. Όμως, δεν υπάρχουν μέχρι σήμερα αρκετές in vivo μελέτες που να καταδεικνύουν ότι αναστέλλοντας το ένζυμο κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας, οδηγεί σε μείωση της έκτασης του εμφράγματος και των νεκρωτικών βλαβών στο μυοκάρδιο. Σκοπός: Η παρούσα μελέτη είχε σκοπό να αναδείξει νέους αναστολείς του ενζύμου ΑΤΡ συνθάση (για την υδρολυτική λειτουργία του) μέσα από μία σειρά 53 ενώσεων. Κατόπιν, οι αναστολείς που επελέγησαν, αξιολογήθηκαν περεταίρω in vitro και in vivo, ώστε να προσδιοριστεί η ικανότητα μείωσης της έκτασης του εμφράγματος. Μέθοδοι: In silico αξιολόγηση: Ενώσεις από δύο βιβλιοθήκες (pharmalab και NCI) αξιολογήθηκαν με in silico τεχνικές και προέκυψε ένα σύνολο 53 πιθανών αναστολέων. Τεχνική Ι: Το σύνολο των ενώσεων αξιολογήθηκε in vitro σε απομονωμένα μιτοχόνδρια από καρδιακό ιστό μυών. Στόχος, ήταν να επιλεγούν οι δραστικότεροι αναστολείς στη συγκέντρωση των 200 μΜ. Κατόπιν, για τις πλέον δραστικές ενώσεις, προσδιορίζεται η τιμή IC50 με παρόμοια διαδικασία. Τεχνική ΙΙ: Οι δραστικές ενώσεις αξιολογήθηκαν για το αν επηρεάζουν τον μιτοχονδριακό πόρο διαπερατότητας (mPTP). Η αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε σε απομονωμένα μιτοχόνδρια από καρδιακό ιστό μυών. Τεχνική ΙΙΙ: Οι πλέον δραστικές ενώσεις αξιολογήθηκαν ως προς: α) την ανασταλτική τους ικανότητα επί του ενζύμου, β) την εκλεκτικότητά τους για την αναστολή της υδρολυτικής λειτουργίας και γ) την ικανότητα να διαπερνούν τις κυτταρικές μεμβράνες. Η αξιολόγηση είναι έμμεση και πραγματοποιήθηκε σε H2C9 κύτταρα. Αξιολογήθηκε και ο πρότυπος εκλεκτικός αναστολέας ΒΤΒ 06584 (τα πειράματα αυτά πραγματοποιήθηκαν στο πανεπιστήμιο UCL στην Αγγλία). Τεχνική IV: Οι καλύτερες ενώσεις, και η ένωση ΒΤΒ, εξετάστηκαν ως προς τη δραστικότητά και την τοξικότητά τους σε απομονωμένα καρδιομυοκύτταρα από καρδιακό ιστό επιμύων (τα πειράματα αυτά πραγματοποιήθηκαν στο πανεπιστήμιο UCL στην Αγγλία). In vivo πρωτόκολλο: 30 μύες C57BL/6 τυχαιοποιήθηκαν σε 6 ομάδες και υποβλήθηκαν χειρουργικά σε 30’ ισχαιμία ακολουθούμενη από 2 ώρες επαναιμάτωση. 5’ πριν την ισχαιμία, χορηγήθηκαν: στην ομάδα ελέγχου Ι φυσιολογικός ορός με Tween 5% (διαλύτης των μορίων 1117, 1119), στην ομάδα ελέγχου ΙΙ φυσιολογικός ορός με 5% DMSO (διαλύτης της ολιγομυκίνης και του BTB ), στην ομάδα Α η ένωση 1117 με δοσολογία 3,6 mg/Kg, στην ομάδα Β η ένωση 1119 με δοσολογία 3,5 mg/Kg, στην ομάδα Γ η ένωση ολιγομυκίνη με δοσολογία 0,95 mg/Kg και στην ομάδα Δ η ένωση BTB με δοσολογία 5 mg/Kg. Κάθε ομάδα είχε n=5 ζώα και η χορήγηση των μορίων πραγματοποιήθηκε ενδοφλέβια. Αποτελέσματα: Από τις 53 ενώσεις που δοκιμάστηκαν, ενώσεις με σκελετό πυραζολοπυριδίνης και βενζοφουρανίου έδειξαν ανασταλτική δράση. Επελέγησαν 3 από τις καλύτερες ενώσεις για περαιτέρω διερεύνηση βάση της τιμής IC50. Οι ενώσεις 1117, 1119 και 1124 εμφάνισαν 75,93% ± 4,22 57,80 % ± 9,75 και 50,86 % ± 17,34 αναστολή του ενζύμου στα 200μΜ αντίστοιχα. Οι παραπάνω ενώσεις εμφάνισαν τιμές IC50 81,7 ± 1,3 μΜ, 99,8 ± 1,2 μΜ και 144,8 ± 1,3 μΜ αντίστοιχα. Καμία από τις παραπάνω ενώσεις δεν αλληλεπιδρά με τον mPTP. Και οι 3 ενώσεις διαπερνούν τις κυτταρικές μεμβράνες. Οι 2 εξ’ αυτών (1117,1119) είναι εκλεκτικές σε συγκέντρωση 50μΜ, ενώ όλες οι ενώσεις εμφάνισαν τοξικότητα σε συγκεντρώσεις άνω των 50μΜ. Τελικά οι ενώσεις 1117 και 1119 δοκιμάσθηκαν in vivo. Και οι 2 μειώνουν στατιστικά σημαντικά την έκταση της εμφραγματικής περιοχής. Το ποσοστό της ισχαιμικής περιοχής ως προς την περιοχή σε κίνδυνο για την ομάδα της ένωσης 1119 είναι ίσο με 33,4% ± 4,8 και για την ομάδα της ένωσης 1117 34,8% ± 3,7 (έναντι της ομάδας control Tween με 45,4% ± 3,8). Η ένωση ΒΤΒ δεν επέδειξε στατιστικά σημαντική μείωση (39,6% ± 3,9 έναντι της ομάδας control DMSO με 44,4% ± 3,5), ενώ η ολιγομυκίνη επέδειξε (28,3% ± 2,8). Συμπεράσματα: Από την παρούσα μελέτη προέκυψαν δύο νέοι μοριακοί σκελετοί και 3 νέοι αναστολείς της υδρολυτικής λειτουργίας της ΑΤΡ συνθάσης. Οι 2 από τους 3 αναστολείς και η ολιγομυκίνη κατάφεραν να μειώσουν την έκταση της εμφαγματικής περιοχής που δημιουργείται σε κατάσταση ισχαιμίας όταν χορηγηθούν 5’ πριν από αυτή. Χρειάζονται περεταίρω μελέτες για τη διερεύνηση της δράσης των ενώσεων κατά την χορήγησή τους κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας καθώς και για την εξακρίβωση του ακριβή μηχανισμού δράσης.
