Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Δοντά Αικατερίνη, Αναπλ. Καθηγήτρια, Τμήμα Οδοντιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, ΕΚΠΑ.
Βοργιάς Κωνσταντίνος, Καθηγητής, Τμήμα Βιοχημείας, Σχολή Θετικών Επιστημών, ΕΚΠΑ.
Τσιχλάκης Κώστας, Καθηγητής, Τμήμα Οδοντιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, ΕΚΠΑ.
Μαργαρίτης Λουκάς, Ομότιμος Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Σχολή Θετικών Επιστημών, ΕΚΠΑ.
Γκρίτζαλης Παναγιώτης, Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Οδοντιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, ΕΚΠΑ.
Παπαδάκης Ευάγγελος, Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Οδοντιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, ΕΚΠΑ.
Πιπέρη Ευαγγελία, Επίκουρη Καθηγήτρια, Τμήμα Οδοντιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, ΕΚΠΑ.
Περίληψη:
Σκοπός
Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι να μελετηθούν συγκεκριμένα κομβικά μόρια που σχετίζονται με την ανταπόκριση και την επιδιόρθωση του DNA μετά από ιοντίζουσα ακτινοβολία σε ανθρώπινη κυτταρική σειρά και σε συνθήκες που είναι πολύ κοντά στις συνθήκες ακτινοβόλησης και δόσης που λαμβάνουν τα επιθηλιακά κύτταρα του στοματικού επιθηλίου των εξεταζόμενων ασθενών. Οι μοριακοί δείκτες σχετίζονται με:
• τον κυτταρικό κύκλο λόγω της πιθανής επαγωγής της πρωτεΐνης p21waf1, η οποία αποτελεί δείκτη αναστολής του πολλαπλασιασμού του κυττάρου στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου,
• τη βιωσιμότητα των ακτινοβολημένων κυττάρων όπως αυτή προσδιορίζεται με τη χρήση της δοκιμασίας MTT από 30 λεπτά μέχρι και 48 ώρες μετά την ακτινοβόληση,
• τον εντοπισμό θραύσεων της διπλής έλικας του DNA μέσω της ανίχνευσης της φωσφορυλιωμένης μορφής της γΗ2ΑΧ
• την ενεργοποίηση του μηχανισμού υψηλής πιστότητας επιδιόρθωσης του γονιδιώματος με ομόλογο ανασυνδυασμό που ενεργοποιείται μέσω της πρωτεΐνης BRCA1 και της συμμετοχής της πρωτεΐνης Rad51,
• την επαγωγή της κυτταρικής απόπτωσης όπως ανιχνεύεται από τη ανάλυση της επαγωγής του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53 και
• τα επίπεδα της ενεργότητας κινασών επαγώμενες από το στρες των κυττάρων, π.χ. όπως οι CK1 κινάσες, που ρυθμίζουν τις λειτουργίες των p53, BRCA1 και Rad51 μέσω φωσφορυλίωσης σε ειδικές θέσεις.
Υλικά και μέθοδοι
Για την ακτινοβόληση των κυττάρων σχεδιάστηκε και κατασκευάστηκε μία συσκευή από plexiglass (phantom) ώστε οι συνθήκες να προσομοιάζουν τις πραγματικές συνθήκες ακτινοβόλησης του ασθενή.
H παραπάνω κατασκευή που προσομοιώνει το ανθρώπινο κεφάλι αποτελείται από δύο ομόκεντρους κυλίνδρους μεταξύ των οποίων υπάρχει απιονισμένο νερό. Στο phantom υπάρχει υποδοχή για να δεχθεί μέχρι και τρία τρυβλία διαμέτρου 8 εκατοστών ή ένα κυτίο κυτταροκαλλιέργειας, μέσα στα οποία τοποθετούνται τα κύτταρα προς ακτινοβόληση, σύμφωνα με τις προτεινόμενες δόσεις ακτινοβολίας του τομογράφου. Πριν την ακτινοβόληση των κυττάρων έγινε βαθμονόμηση της συσκευής phantom με δοσίμετρα θερμοφωταύγειας (TLD). Η ακτινοβολία μετρήθηκε με δοσίμετρα (TLD) τα οποία τοποθετήθηκαν τόσο στην εσωτερική όσο και στην εξωτερική επιφάνεια του κυλίνδρου και σε διαφορετικά σημεία του phantom. Η ακτινοβόληση έγινε κάτω από παρόμοιες συνθήκες με τις συνθήκες ακτινοβόλησης του ασθενή, τα δοσίμετρα συλλέχθηκαν και η απορροφούμενη δόση μετρήθηκε στο Εργαστήριο Δοσιμετρίας του ΕΚΕΦΕ Δημόκριτος. Οι προτεινόμενες συνθήκες ακτινοβόλησης αντιστοιχούν σε δόσεις που λαμβάνει ένα ενήλικο άτομο μέσης σωματικής διάπλασης.
Οι ακτινοβολήσεις μεγάλου αριθμού κυττάρων πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον σε δύο ανεξάρτητες χρονικές στιγμές, σε τριπλά δείγματα και το βιολογικό υλικό χρησιμοποιήθηκε για την μελέτη των διαφόρων παραμέτρων.
Η ακτινοβόληση των κυττάρων έγινε στον Οδοντιατρικό Υπολογιστικό Τομογράφο Newtom 9000 QR Verona Italy 110KV, που βρίσκεται στην Οδοντιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου Αθηνών, στο μέγιστο FOV (field of view) 15cm διαμέτρου με στοιχεία 3,2 mA και 17sec χρόνο ακτινοβόλησης
Επίσης, για να έχουμε ένα θετικό μάρτυρα για τα πειράματα, το πειραματικό μας υλικό ακτινοβολήθηκε σε δόσεις 2 Gy (Gray) ανά λεπτό. Η ακτινοβόληση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με πηγή κοβαλτίου-60 (60Co) GammaCell 220 Irradiator (Atomic Energy of Canada Ltd, Ottawa, Canada, Ιανουάριος 1974), που βρίσκεται στις εγκαταστάσεις του Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «Δημόκριτος».
Συνολικά έγιναν 50 ακτινοβολήσεις στον Ο.Υ.Τ. που χρειάστηκαν για όλες τις μοριακές μεθόδους που επιλέξαμε αλλά και για να και να εξασφαλίσουμε την επαναληψιμότητα στα αποτελέσματα μας. Στον GammaCell 220 Irradiator πραγματοποιήθηκαν 10 τέτοιες ακτινοβολήσεις για τις μεθόδους western και ανοσοφθορισμού.
Μετά τις ακτινοβολήσεις τα κύτταρα επωάστηκαν για διαφορετικά χρονικά διαστήματα ανάλογα με την μοριακή μέθοδο που επιλέξαμε. Σαν πειραματικό υλικό για την παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά HEK 293 η οποία αναπτύχθηκε σε απλή στοιβάδα (2D καλλιέργεια) σε γυάλινες καλυπτρίδες. . Τα κύτταρα αφήνονται να αναπτυχθούν μέχρι να καλύψουν το 70-90% της επιφάνειας της καλυπτρίδας για μην υπάρξει αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και τροποποίηση των μεταβολικών τους διαδικασιών λόγω της έλλειψης χώρου (contact inhibition) και στη συνέχεια αντινοβολούνται. Κάθε τριβλίο περιείχε κύτταρα σε συγκέντρωση 1-2x105 κύτταρα/mL . Μη ακτινοβοληθέντα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.
To πειραματικό μέρος της διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Τομέα Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Αθηνών (Υπεύθυνος Καθ. Κ. Ε. Βοργιάς). Για την εκτέλεση των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε ο εξοπλισμός του εργαστηρίου, καθώς και όλα τα αναγκαία υλικά. Πιο συγκεκριμένα, έγινε συνδυασμένη χρήση κυτταρολογικών και μοριακών τεχνικών (Μέθοδος ΜΤΤ, Ανοσοφθορισμός, Real Time PCR, Ανασοστύπωση κατά Western, μελέτη της ενεργότητας της κινάσης καζεϊνης 1).
Πρέπει να τονισθεί ότι το κέντρο βάρος της μελέτης ήταν η ανίχνευση βραχυχρόνιων βλαβών και η μέτρηση της άμεσης ανταπόκρισης των κυτταρικών μηχανισμών επιδιόρθωσης προς πλήρη ανάκτηση των κυττάρων ή η απαρχή αποπτωτικών διαδικασιών.
Αποτελέσματα
• Με τη μέθοδο MTT για πιθανή επαγωγή της κυτταροτοξικότητας στην ακτινοβολημένη κυτταρική σειρά HEK293, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα επίπεδα επιβίωσης των κυττάρων μετά την ακτινοβόληση δεν είχαν σημαντικές διαφορές σε σχέση με τα κύτταρα που δεν ακτινοβολήθηκαν (μάρτυρας).
• Με τη μέθοδο της ανοσοστύπωσης κατά Western για την έκφραση των πρωτεϊνών, Rad51, BRCA1, p21 και p53 στα ακτινοβολημένα κύτταρα, τα αποτελέσματα έδειξαν αύξηση στην BRCA1 στα κύτταρα που ακτινοβολήθηκαν με 2 Gy τόσο στα 20 λεπτά όσο και στις 4 ώρες ενώ καμία μεταβολή δεν παρατηρήθηκε στην έκφραση των πρωτεινών τόσο στα κύτταρα που ακτινοβολήθηκαν στον Ο.Υ.Τ. όσο και στα κύτταρα μάρτυρες σε όλα τα χρονικά διαστήματα.
• Με τη μέθοδο της ανοσοστύπωσης κατά Western για την έκφραση της P-γΗ2ΑΧ στα ακτινοβολημένα κύτταρα όσο και στα κύτταρα μάρτυρες, τα αποτελέσματα έδειξαν μία αύξηση της P-γ2ΑΧ στα κύτταρα που ακτινοβολήθηκαν στον Ο.Υ.Τ. στο πρώτο μισάωρο σε σχέση με τα κύτταρα μάρτυρες. Στις 6 ώρες το σήμα μειώνεται ενώ στις 48 ώρες δεν υπάρχουν ευρήματα.
• Τα αποτελέσματα του ανοσοφθορισμού για τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό των πρωτεϊνών Rad51, BRCA1 και p53, 0,5h και 24h μετά την ακτινοβόληση στον Ο.Υ.Τ έδειξαν μία μικρή αύξηση στο σήμα της Rad 51 μισή ώρα μετά την ακτινοβόληση. 24 ώρες μετά επανέρχεται σε φυσιολογικά επίπεδα. Καμία μεταβολή για τις BRCA1 και P53.
• Για την ανίχνευση της δημιουργίας θραυσμάτων της διπλής έλικας του DNA μέσω ανοσοφθορισμού της φωσφορυλιωμένης μορφής της γ-H2AX έγινε σε κάθε κύτταρο καταμέτρηση με αυτοματοποιημένο τρόπο του αριθμού των εστιών (foci)/πυρήνα σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα. Τα αποτελέσματα έδειξαν μία αύξηση του αριθμού των foci/πυρήνα τόσο στα πρώτα 20 λεπτά όσο και στα 240 λεπτά ενώ 48h μετά την ακτινοβόληση στον Ο.Υ.Τ. δεν ανιχνεύθηκαν σήματα υπολειμμάτων θραύσεων της διπλής έλικας του DNA, αφού η γ-Η2ΑΧ ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμη. Ο έλεγχος πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά σε τόσο μεγάλο αριθμό κυττάρων (12.000).
• Μετά την ακτινοβόληση των κυττάρων HEK293 πραγματοποιήθηκε απομόνωση ολικού RNA το οποίο φάνηκε ότι παραμένει ακέραιο.
• Με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real Time PCR) για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης των γονιδίων BRCA1, P21, Rad51 και p53 σε ακτινοβολημένα κύτταρα, τα αποτελέσματα έδειξαν μία μικρή αύξηση της Rad51 μισή ώρα μετά την ακτινοβόληση στα κύτταρα που ακτινοβολήθηκαν στον Ο.Υ.Τ σε σχέση με τα κύτταρα μαρτυρες. Τα υπόλοιπα γονίδια δεν παρουσίασαν ουσιαστικές μεταβολές. Επίσης, παρατηρήθηκε μείωση της έκφρασης της p21 σε όλα τα χρονικά διαστήματα μετά την ακτινοβόληση.
• Η μελέτη της ενεργότητας της κινάσης καζεϊνης 1 (CK1) με in vitro φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων της σε εκχυλίσματα κυττάρων μετά την ακτινοβόληση έδειξε ότι τα κύτταρα που ακτινοβολήθηκαν με αυξημένη δόση ακτινοβολίας (2Gy) παρουσιάζουν αυξημένη ενεργότητα κινάσης CK1 τόσο 20min όσο και 240min μετά την ακτινοβόληση. Αντίθετα, στα κύτταρα που ακτινοβολήθηκαν στον οδοντιατρικό υπολογιστικό τομογράφο, η ενεργότητα της CK1 κινάσης είναι πολύ χαμηλή.
Συμπεράσματα
1) Δεν παρατηρήθηκε αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων όπως διαπιστώθηκε με την σταθερή τιμή των επιπέδων της p21 σε όλα τα χρονικά διαστήματα που μελετήθηκε μετά την ακτινοβόληση
2) Παρατηρήθηκε αύξηση στην έκφραση του γονιδίου της πρωτείνης Rad51, στις 0,5h μετά την ακτινοβόληση, στις 24h με την μέθοδο του ανοσοφθορισμού και στις 48h μέσω ανοσολογικής ποσοτικοποίησης η έκφραση του γονιδίου της Rad51 μειώνεται σημαντικά στα ακτινοβολημένα κύτταρα με όλες τις μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν.
3) Η ενεργότητα της CK1 κινάσης (που ρυθμίζει τις λειτουργίες των p53, BRCA1 και Rad51 μέσω φωσφορυλίωσης σε ειδικές θέσεις) ήταν πολύ χαμηλή στα κύτταρα που ακτινοβολήθηκαν στον οδοντιατρικό υπολογιστικό τομογράφο. Συγκεκριμένα, ήταν πιο χαμηλή και από τα μη ακτινοβολημένα κύτταρα, τα οποία όμως είχαν υποστεί το στρες που παρέμειναν εκτός κλιβάνου τουλάχιστον 20 min και όπως είναι γνωστό η ενεργότητα της κινάσης CK1 αυξάνεται όταν υπάρχει κυτταρικό στρες.
4) Η βιωσιμότητα των ακτινοβολημένων κυττάρων, όπως αυτή εκτιμάται με τη χρήση της δοκιμασίας MTT μετά από κινητική ανάλυση σε χρονικό διάστημα από 30 λεπτά μέχρι και 48 ώρες μετά την ακτινοβόληση, δεν είχε σημαντικές διαφορές σε σχέση με τα κύτταρα που δεν ακτινοβολήθηκαν.
5) Δεν ανιχνεύθηκαν σήματα υπολειμμάτων θραύσεων της διπλής έλικας του DNA 48h μετά την ακτινοβόληση, αφού η γ-Η2ΑΧ ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμη. Ο έλεγχος πραγματοποιήθηκε τόσο μέσω ανοσολογικής ποσοτικοποίησης όσο και μέσω του ανοσοφθορισμού για πρώτη φορά σε τόσο μεγάλο αριθμό κυττάρων.
6) Δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές στα επίπεδα της πρωτεΐνης BRCA1 που συμμετέχει στην ενεργοποίηση του μηχανισμού υψηλής πιστότητας επιδιόρθωσης του γονιδιώματος μέσω ομολόγου ανασυνδυασμού. Ο έλεγχος πραγματοποιήθηκε μέσω RT-PCR, μέσω ανοσολογικής ποσοτικοποίησης όσο και μέσω του ανοσοφθορισμού σε κύτταρα.
7) Η p53 που είναι γνωστή ως ο κομβικός ρυθμιστικός παράγοντας του κυτταρικού κύκλου και την απόπτωση των κυττάρων δεν εμφάνισε κάποια αλλαγή στην ένταση του φθορισμού της τόσο 0,5h όσο και 24h μετά την ακτινοβόληση, με όλες τις μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν.
8) Με τις περιγραφόμενες πειραματικές συνθήκες και με την χρήση πολλαπλών κυτταρολογικών και γονιδιακών βιοδεικτών συμπεραίνουμε ότι η ακτινοβόληση των κυττάρων για την χρονική διάρκεια που απαιτείται για την οδοντιατρική εξέταση δημιούργησε περιορισμένο αριθμό δίκλωνων θραυσμάτων DNA τα οποία τα κύτταρα τα επιδιόρθωσαν σε χρονικό διάστημα που είναι μικρότερο του χρόνου του κυτταρικού κύκλου. Επομένως κατά την πειραματική αυτή διαδικασία δε δημιουργήθηκαν σημαντικές μη αντιστρέψιμες βλαπτικές αλλοιώσεις.
9) Δεν φαίνεται να λαμβάνει χώρα κατά τις συγκεκριμένες συνθήκες ακτινοβόλησης, ενεργοποίηση του μηχανισμού υψηλής πιστότητας επιδιόρθωσης όπως φάνηκε από την απουσία μεταβολών στα επίπεδα της BRCA (ανάλυση με RT-PCR).
