Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Αντώνης Κολοκούρης, Καθηγητής, Τμήματος Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ.
Graham Ladds, Professor, Department of Pharmacology, University of Cambridge.
Εμμανουήλ Μικρός, Καθηγητής Τμήματος Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ.
Αθανάσιος Παπακυριακού, Iνστιτούτο Βιοεπιστημών και Εφαρμογών, Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών
Επιστημών, Δημόκριτος.
Νικόλαος Λουγιάκης, Eπικ. Καθηγητής Τμήματος Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ.
Μίνος Ματσούκας, Eπικ. Καθηγητής Τμήματος Μηχανικών Βιοϊατρικών Επιστημών, ΠΑΔΑ.
Θωμάς Μαυρομούστακος, Kαθηγητής Τμήματος Χημείας, ΕΚΠΑ.
Περίληψη:
Στην προσπάθεια ανάπτυξης αποτελεσματικών θεραπειών, ο σχεδιασμός φαρμάκων βασισμένος στη δομή έχει αναδειχθεί ως μια ισχυρή προσέγγιση, εκμεταλλευόμενος την κατανόησή των μοριακών δομών για τον σχεδιασμό μορίων με βελτιωμένες ιδιότητες δεσμευτικότητας και λειτουργίας. Η αναζήτηση αποτελεσματικών θεραπειών που στοχεύουν στους υποδοχείς της αδενοσίνης (ARs), μέλη της οικογένειας των υποδοχέων που συνδέονται με G πρωτείνες (GPCRs), έχει αποκτήσει σημαντική σημασία λόγω της συμμετοχής τους σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις.
Σκοπός αυτής της διατριβής είναι η ανάπτυξη ανταγωνιστών που στοχεύουν τους υποδοχείς της αδενοσίνης Α1 και Α3. Για την επίτευξη αυτού του στόχου, χρησιμοποιούνται προηγμένες υπολογιστικές μέθοδοι, όπως η αλχημική διαταραχή της ελεύθερης ενέργειας και υπολογισμοί κινητικής δεσμευτικότητας. Στο Κεφάλαιο 1, παρέχεται μια εισαγωγή στους GPCRs με έμφαση στους ARs. Αναφέρονται γνωστοί αγωνιστές, ανταγωνιστές και διπλοί ανταγωνιστές που δρουν στα ορθοστερικά και αλλοστηρικά σημεία των ARs. Το Κεφάλαιο 2 περιγράφει τις αρχές των χρησιμοποιούμενων μεθοδολογιών στην παρούσα διατριβή.
Στο Κεφάλαιο 3, τα συνθετικά παράγωγα των 7-αρυλικών ή αλκυλαμινο-πυραζολο[3,4-δ]πυριδαζίνη παρείχαν μια νέα πλατφόρμα για την ανάπτυξη δεσμευτών ενάντια στους ARs. Οι ενώσεις συντέθηκαν στο εργαστήριο της συνθετικής χημείας του ΕΚΠΑ υπό την επίβλεψη των καθηγητών Παναγιώτη Μαράκου, Νικόλ Πουλή και επίκουρου καθηγητή Νικόλαου Λουγιάκη και η βιολογική αξιολόγηση των ενώσεων έγινε με φαρμακολογικές και βιοφυσικές μεθόδους από το εργαστήριο φαρμακολογίας του καθηγητή Graham Ladds στο Πανεπιστήμιο του Cambridge. Η εισαγωγή ομάδας 3-φαινυλίου, μαζί με μια ομάδα 7-βενζυλαμίνης και μια ομάδα 1-μεθυλίου στην πυραζολοπυριδαζίνη παρήγαγε την ένωση ανταγωνιστή 10b με 26 nM συγγένεια δέσμευσης (Ki) και χρόνος παραμονής στον υποδοχέα (RT) 60 λεπτά για τον A1R, 7,4 nM Ki και RT = 73 λεπτά για τον A3R και χαμηλό μΜ Κi για τον A2BR. Η αντικατάσταση του N-μεθυλίου στον δακτύλιο της πυραζόλης είχε εντυπωσιακή επίδραση στη βιοδραστικότητα, καθώς το αντίστοιχο 2-μεθυλ-3-φαινυλικό παράγωγο 15b, δεν είχε σημαντική συγγένεια δέσμευσης, ενώ όταν η 3-φαινυλική ομάδα του 10b αντικαταστάθηκε από μια ομάδα ισοπροπυλίου, το αποτέλεσμα που προέκυψε, το αντίστοιχο παράγωγο 10a, είχε σημαντικά μειωμένη συγγένεια δέσμευσης. Συγκρίναμε τα προφίλ δέσμευσης των 10b και 15b με προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής (MD) και τα αποτελέσματα υποδήλωσαν ότι η ομάδα 2-μεθυλίου στο 15b εμποδίζει την δημιουργία δεσμών υδρογόνου με το N6.55 που θεωρείται κρίσιμο αμινοξύ για τη σταθεροποίηση μέσα στην ορθοστερική κοιλότητα. Οι πειραματικές μελέτες γενετικής μετάλλαξης για το 10b στον A1R παρείχαν αποτελέσματα που συμπληρώνουν τις παρατηρήσεις από τις προσομοιώσεις MD. Δείξαμε ότι η μετάλλαξη L2506.51A οδήγησε μόνο σε μια ελαφρά μείωση της συγγένειας δέσμευσης όσον αφορά το 10b, ενώ η μετάλλαξη Y2717.46A προκάλεσε μια μείωση 10 φορές στην συγγένεια πρόσδεσης αυτού του παραγώγου. Η μετάλλαξη σε αλανίνη των αμινοξέων T913.36, H2516.52 ή S2677.42, που βρίσκονται βαθιά στην ορθοστερική θέση δέσμευσης, δεν επηρέασε την συγγένεια δέσμευσης.
Στο Κεφάλαιο 4, αναφέρεται ο εντοπισμός των 7-(φαινυλαμίνων)-πυραζολο[3,4-κ]πυριδίνων L2-L10, A15 και A17 ως νανομοριακοί ανταγωνιστές των A1R/A3R, με την ένωση 3-φαινυλ-5-κυανο-7-(τριμεθοξιφαινυλαμίνο)-πυραζολο[3,4-κ]πυριδίνης (A17) να εμφανίζει την υψηλότερη συγγένεια και για τους δύο υποδοχείς όπως καθορίστηκε φαρμακολογικά με τη δοκιμασία NanoBRET. Στις προσομοιώσεις MD, δύο πιθανοόι προσανατολισμοί δεσμεύσεων του A17 παρήγαγαν σταθερά σύμπλοκα μέσα στην ορθοστερική περιοχή του A1R. Επιλέξαμε τον πιο πιθανό προσανατολισμό βασιζόμενοι στις μελέτες μεταλλαξηγένεσις. Ενδιαφέρον έδειξε η μετάλλαξη του αμινοξέος L2506.51 σε αλανίνη, η οποία αύξησε την συγγένεια δέσμευσης του A17 για τον A1R. Εξετάσαμε τις σχέσεις δομής-δράσης κατά τον A1R χρησιμοποιώντας υπολογισμούς θερμοδυναμικής ολοκλήρωσης (ΤΙ/ΜD), μέθοδος που απορρέει χωρίς προσεγγίσεις (ab initio) από θεωρήματα στατιστικής μηχανικής για θερμοδυναμικά συστήματα, που εφαρμόστηκε σε ολόκληρο το σύστημα GPCR-μεμβράνης, το οποίο έδειξε καλή συσχέτιση (r = 0,73) μεταξύ των υπολογισμένων και των πειραματικών αποτελεσμάτων.
Στο Κεφάλαιο 5, αναπτύξαμε ένα υπολογιστικό μοντέλο του ανενεργού A3R, που δεν έχει ακόμα επιλυθεί πειραματικά, για σκοπούς σχεδιασμού φαρμάκων. Δοκιμάσαμε πέντε υπολογιστικά ομόλογο μοντέλα του ανενεργού A3R που είναι είτε διαθέσιμα δημόσια είτε διαθέσιμα από ένα διαδικτυακό εργαλείο. Kαταλήξαμε στα υπολογιστικά Μοντέλα 1 και 2 που παράχθηκαν από πειραματικές δομές του ανενεργού A2AR ή του Α1R και το βασισμένο στο AlphaFold2 Μοντέλο 3. Διαπιστώσαμε ότι τα μοντέλα έδειξαν σχετική συμφωνία στον προσανατολισμό των πλευρικών αλυσίδων στην ορθοστερική περιόχη πρόσδεσης, εκτός από την ανώτερη περιοχή όπου τα Μοντέλα 1, 2 διέφεραν από το Μοντέλο 3 στον προσανατολισμό των πλευρικών αλυσίδων των αμινοξέων R1735.34, M1725.33 και M1745.35 που βρίσκονται στο εξωκυττάριο βρόγχο 2 (EL2) και θεωρητικά θα μπορούσαν να λειτουργούν ως εμπόδιο στην έξοδο των φαρμάκων. Συγκρίναμε τα Μοντέλα 1-3 ως προς τις προβλέψεις της πειραματικά καθορισμένης θερμοδυναμικής και κινητικής σταθερότητας για την σειρά των αντγωνιστών πυραζολο[3,4-κ]πυριδίνων. Τα μοντέλα πρωτεΐνης 1-3 στους υπολογισμούς TI/MD παρουσίασαν καλή συσχέτιση (συντελεστής συσχέτισης Pearson r = 0,74, 0,62 και 0,67, αντίστοιχα) μεταξύ των υπολογισμένων και των πειραματικών αποτελεσμάτων.
Οι υπολογισμοί πρόβλεψης της κινητικής πρόσδεσης των ανταγωνιστών στους υποδοχείς με την μέθοδο τRAMD, κατέταξαν αποτελεσματικά τις ενώσεις ανάλογα με τον χρόνο παραμονής τους μέσα στον υποδοχέα χρησιμοποιώντας τα Μοντέλα 1, 2, αντίθετα στο Μοντέλο 3 ο προσανατολισμός της R1735.34 που βρίσκεται στην κορυφή της διαδρομής εξόδου των φαρμάκων επηρέασε τη έξοδο των ενώσεων. Με τη βελτιστοποίηση του προσανατολισμού των πλευρικών αλυσίδων των αμινοξέων M1725.33, R1735.34, M1745.35 στο Μοντέλο 3 δημιουργήθηκε το βελτιστοποιημένο Μοντέλο 3. Οι προσομοιώσεις του τ-RAMD χρησιμοποιώντας το βελτιστοποιημένο μοντέλο 3 κατέταξαν σωστά τις ενώσεις ανάλογα με τον χρόνο παραμονής τους μέσα στον υποδοχέα δεσμεύσης. Επιπλέον, η απόδοση των υπολογισμών TI/MD με το βελτιστοποιημένο Μοντέλο 3 βελτιώθηκε, καθώς ο συντελεστής συσχέτισης Pearson αυξήθηκε από r = 0,67 σε r = 0,84, ενώ η μέση ανισορροπία μειώθηκε από 0,81 kcal mol-1 σε 0,56 kcal mol-1.
