Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Καθηγητής Α.Ζ.Τσακρής, Επίκουρη Καθηγήτρια Γ.Βρυώνη, Επίκουρη Καθηγήτρια Β.Καψιμάλη
Περίληψη:
Η παρούσα διατριβή περιστρέφεται γύρω από δύο κεντρικούς άξονες, αφενός την
καταγραφή και διερεύνηση πλασμιδιακών AmpC β-λακταμασών σε στελέχη
εντεροβακτηριακών, τη συγκριτική εκτίμηση της αποτελεσματικότητας διαφόρων
αναστολέων στην ανίχνευση τους, την αξιολόγηση ενός τροποποιημένου CLSI ESBL
τεστ και αφετέρου την καταγραφή και διερεύνηση νεωτέρων καρβαπενεμασών που
έχουν ανιχνευθεί πρόσφατα στην Ελληνική επικράτεια.
Για την μελέτη των πλασμιδιακών AmpC β-λακταμασών έγινε έλεγχος 105
Εντεροβακτηριακών στελεχών (K.pneumoniae, E.coli, K.oxytoca, P.mirabilis) με
μειωμένη ευαισθησία ή αντοχή στην κεφοξιτίνη (FOX) ή/και στην κεφοτετάνη (CTT)
σε συνδιασμό με αντοχή ή μειωμένη ευαισθησία σε μία τουλάχιστον εκτεταμένου
φάσματος κεφαλοσπορίνη. Οι πλασμιδιακές AmpC, ESBL και VIM καρβαπενεμάσες
ανιχνεύθηκαν με PCR και προσδιορίστηκαν με νουκλεοτιδική αλληλούχιση.
Πραγματοποιήθηκαν τεστ ευαισθησίας με την μέθοδο διάχυσης δισκίων,
προσδιορισμός MIC ερταπενέμης με Etest και διερεύνηση κλωνικότητας με ERIC-PCR
και REP-PCR. Έγινε συγκριτική εκτίμηση τεσσάρων αναστολέων, της κλοξασιλλίνης
(CLOX), του φαινύλ-βορονικού οξέος (PBA), του 3-ακετύλ-φαινύλ βορονικού οξέος
(APA) και του 3-άμινο-φαινύλ βορονικού οξέως (APBA) το τελευταίο σε δύο
συγκεντρώσεις με υποστρώματα την FOX, CTT, κεφταζιδίμη (CAZ) και κεφοταξίμη
(CTX). Τέλος εκτιμήθηκε ένα τροποποιημένο CLSI ESBL τεστ με την χρήση των
προηγούμενων αναστολέων.
Συνολικά βρέθηκαν 59 στελέχη με πλασμιδιακές AmpC β-λακταμάσες, εκ των οποίων
35 έφεραν και ESBL. Η πλειονότητα των στελεχών έφερε την MOX-2 β-λακταμάση και
ακολούθως την CMY-2. Σε μικρότερη συχνότητα βρέθηκαν η CMY-4, CMY-13 και CMY-31
καθώς και τρία πρωτοεμφανιζόμενα στην Ελλάδα ένζυμα η DHA-1 και δύο νεώτερες β-
λακταμάσες μια CMY-4-like και μία MIR-2-like. Τα στελέχη P.mirabilis ανήκαν σε
ένα κλώνο, οι K.oxytoca εμφάνιζαν δύο κλώνους με ένα διακριτό υπότυπο, ενώ οι
E.coli και K.pneumoniae διαχωρίστηκαν σε συνολικά 11 και 8 κλώνους αντίστοιχα.
Η FOX υπερτερούσε σε σχέση με την CTT ως αρχικό screening. Όσον αφορά την
επιβεβαιωτική φαινοτυπική μέθοδο η FOX σε συνδιασμό με το APBA δίνει τα
καλύτερα αποτελέσματα αναγνωρίζοντας επιτυχώς 57/59 στελέχη. Το τροποποιημένο
CLSI ESBL τεστ υπερείχε σημαντικά σε ευαισθησία και ειδικότητα με την χρήση
CLOX (91,4%, 75%), PBA (100%, 75%) ή APBA (97,1%, 79,1%) σε σχέση με το
κλασσικό CLSI ESBL τεστ (85,7%, 58,3%). Συνολικά καλύτερα αποτελέσματα
επιτεύχθηκαν με την χρήση του PBA. Το APA απέτυχε να λειτουργήσει ικανοποιητικά
εμφανίζοντας χαμηλή ευαισθησία (54,3%).
Στην περίπτωση των NDM καρβαπενεμασών συνολικά έγινε έλεγχος 132
Εντεροβακτηριακών στελεχών με αντοχή στις καρβαπενέμες που είχαν συλλεχθεί από
τον Ιανουάριο 2010 έως τον Ιούνιο 2013, έδιναν θετικό το τροποποιημένο Hodge
τεστ (MHT) και τις φαινοτυπικές δοκιμασίες για παραγωγή μέταλλο-β-λακταμάσης
(MBL). Συνολικά 78 στελέχη K.pneumoniae, που συγκεντρώθηκαν από 71 ασθενείς
έφεραν το blaNDM-1 γονίδιο. Η πλειονότητα των στελεχών ήταν επίσης θετικά και
για τα blaOXA-1, blaCTX-M-15 και blaTEM-1 γονίδια.. Η πλασμιδιακή ανάλυση
έδειξε ότι το blaNDM-1 γονίδιο φέρεται επί ενός πλασμιδίου μεγέθους ~95kbp και
ανήκει στο IncFII γκρουπ ασυμβατότητας. Ανάλυση του γενετικού περιβάλλοντος του
blaNDM-1 γονιδίου έδειξε ότι του γονιδίου προηγείτο ένα μη διακεκομμένο
ISAba125 στοιχείο ενώ μετά το γονίδιο ακολουθεί το bleMBL γονίδιο. Η ERIC-PCR
και η PFGE ανέδειξαν ότι όλα τα στελέχη ανήκαν σε ένα διακριτό κλώνο Α, με μια
υποομάδα Α1 και η MLST αντιστοίχησε τα στελέχη στο τύπο ST11. Μεταφορά της
αντοχής στις καρβαπενεμάσες επιτεύχθηκε με πάρα πολύ χαμηλή συχνότητα ~
1,3x10-7 διασυζευτικά στελέχη ανά κύτταρο δότη. Παρατηρήθηκαν δύο επιδημίες, η
πρώτη από Νοέμβριο-Δεκέμβριο 2011, με 4 εμπλεκόμενους ασθενείς και η δεύτερη με
έναρξη το Μάιο 2012 και συνεχιζόμενη, με τα υπόλοιπα περιστατικά. Για δύο
ασθενείς θεμελιώθηκε η αυτόχθονος πρόσληψη των στελεχών από την κοινότητα. Δεν
βρέθηκαν συνδετικά στοιχεία που να βεβαιώνουν έκθεση των περιστατικών σε
ενδημικές περιοχές.
Από τον Δεκέμβριο 2011 έως το Μάρτιο 2012 13 στελέχη K.pneumoniae με αντοχή
στην ερταπενέμη, με θετικό MHT αλλά αρνητικές φαινοτυπικές δοκιμασίες για
παραγωγή MBL και KPC τύπου καρβαπενεμασών, απομονώθηκαν από 9 ασθενείς.
Όλα τα στελέχη έφεραν το blaOXA-48 γονίδιο καθώς και το blaOXA-1 και
blaCTX-M-15. Το blaOXA-48 γονίδιο εντοπίστηκε επί συζευκτικού πλασμιδίου τάξης
IncL/M μεγέθους ~62kb. Η ανάλυση του γενετικού περιβάλλοντος πιστοποίησε την
παρουσία του IS1999 πριν το γονίδιο, σχηματίζοντας το μεταθετό στοιχείο Tn1999.
Η ανάλυση αλληλουχιών των γονιδίων των μεμβρανικών πρωτεϊνών ompK35 και ompK36
δεν ανέδειξε μεταλλάξεις σχετιζόμενες με προβλήματα διαβατότητας. Η PFGE
ομαδοποίησε τα στελέχη σε ένα διακριτό κλώνο, με δύο υπότυπους (Ια και Ιb) και
η MLST αντιστοίχησε τα στελέχη στο ST11.
Σε χρονικό διάστημα περίπου ίσο με 2,5 χρόνια και έναρξη το 2010 από τρία
δείγματα ούρων ασθενούς, τα δύο πρώτα εκ των οποίων προσκομίσθηκαν με διαφορά
41 ημερών ενώ το τελευταίο μετά από 2,5 χρόνια, απομονώθηκαν στελέχη Κ.
pneumoniae με αντοχή στις κεφαμυκίνες και στις εκτεταμένου φάσματος
κεφαλοσπορίνες, θετικά φαινοτυπικά τεστ για παραγωγή AmpC β-λακταμάσης και
αρνητικό τροποιημένο CLSI-ESBL τεστ. Τα δύο αρχικά στελέχη παρουσίαζαν επίσης
αντοχή στις καρβαπενέμες, θετικό ΜΗΤ και αρνητικά φαινοτυπικά τεστ για παραγωγή
καρβαπενεμάσης τάξης Α ή Β. Η μοριακή διερεύνηση ανέδειξε την παρουσία του
blaOXA-162 γονιδίου καθώς και του blaOXA-1 και του blaDHA-1 στα δύο αρχικά
στελέχη ενώ το τελευταίο ήταν αρνητικό για το blaOXA-162. Το IS1999 προηγείτο
του blaOXA-162. Δεν βρέθηκαν μεταλλάξεις σχετιζόμενες με προβλήματα
διαβατότητας. Η πλασμιδιακή ανάλυση έδειξε την ύπαρξη δύο μεγάλων πλασμιδίων
~140kb και ~62kb καθώς και ενός μικρότερου μεγέθους 2kb στα δύο πρώτα στελέχη,
ενώ στο τελευταίο απουσίαζε το 62kb πλασμίδιο. Τα πειράματα σύζευξης δεν
οδήγησαν στην δημιουργία διασυζευκτών. Η PFGE ομαδοποίησε τα στελέχη σε ένα
διακριτό κλώνο και η MLST τα αντιστοίχησε στο ST11.
Λέξεις-κλειδιά:
Καρβαπενεμάσες, AmpC-β λακταμάσες, Λακταμάσες, Εντεροβακτηριοειδή, Αντοχή
