Εφαρμογή νέων τεχνικών για την ανίχνευση μοριακών διαταραχών σε ασθενείς με δυστροφινοπάθειες χωρίς έλλειψη στο γονίδιο της δυστροφίνης

Διδακτορική Διατριβή uoadl:1306325 123 Αναγνώσεις

Μονάδα:
Τομέας Υγείας - Μητέρας - Παιδιού
Βιβλιοθήκη Επιστημών Υγείας
Ημερομηνία κατάθεσης:
2013-07-04
Έτος εκπόνησης:
2013
Συγγραφέας:
Βογιατζάκης Νικόλαος
Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Καθηγήτρια Γενετικής Σοφία Κίτσιου – Τζέλη
Πρωτότυπος Τίτλος:
Εφαρμογή νέων τεχνικών για την ανίχνευση μοριακών διαταραχών σε ασθενείς με δυστροφινοπάθειες χωρίς έλλειψη στο γονίδιο της δυστροφίνης
Γλώσσες διατριβής:
Ελληνικά
Περίληψη:
Εισαγωγή
Η ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο της δυστροφίνης έχει αποδειχθεί ιδιαίτερα
απαιτητική κυρίως λόγω του μεγάλου μεγέθους του γονιδίου (79 εξόνια, 2,4Μb).
Παρόλο που έχουν αναφερθεί στην βιβλιογραφία «θερμές περιοχές» («Hot Spot»)
όπου συσσωρεύονται ελλείψεις και διπλασιασμοί εξονίων, δεν έχει αναφερθεί ένα
ανάλογο σημείο συσσώρευσης σημειακών μεταλλάξεων οι οποίες απαντώνται
διάσπαρτες καθ ‘όλο το μήκος του γονιδίου.
Μεθοδολογία
Στην μελέτη αυτή παρουσιάζονται τα αποτελέσματα του ελέγχου 645 ασθενών (608
άρρενα άτομα και 37 θήλεα) που παραπέμφθηκαν στο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής
του Πανεπιστημίου Αθηνών τις δυο τελευταίες δεκαετίες για έλεγχο για
δυστροφινοπάθειες. Οι ελλείψεις και οι διπλασιασμοί εντοπίστηκαν
χρησιμοποιώντας το κλασικό πολλαπλό PCR 18 εξονίων αλλά και την τεχνική
πολλαπλής ενίσχυσης υβριδοποιημένων ανιχνευτών με το ένζυμο της λιγάσης
(Multiplex Ligation –dependant Probe Amplification, MLPA). Οι σημειακές
μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο σάρωσης ECMA (Enzymatic
Cleavage Mismatch Analysis protocol, Vogiatzakis et al, 2007; 2010) η οποία
τιτλοποιήθηκε στο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, αρχικά για τις ανάγκες της
παρούσας μελέτης. Οι σημειακές μεταλλάξεις επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση της
πρωτοταγούς δομής του DNA (Direct DNA sequencing). Τα όρια των μεταλλάξεων
(όπου δεν ήταν προφανή) μελετήθηκαν περαιτέρω με πολλαπλό PCR ή MLPA. Για την
σύγκριση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε η τράπεζα μεταλλάξεων για το γονίδιο DMD
του πανεπιστημίου του Leiden, Ολλανδία (www.dmd.nl).
Αποτελέσματα
Η παρούσα μελέτη αποκάλυψε συνολικά 309 μεταλλάξεις και ειδικότερα, 254
ελλείψεις εξονίων, 24 διπλασιασμούς και 31 σημειακές μεταλλάξεις. Επίσης
ταυτοποιήθηκαν αρκετοί πολυμορφισμοί του γονιδίου της δυστροφίνης από τους
οποίους 6 χρήζουν περαιτέρω μελέτης λόγω της αμφίβολης παθογένειας τους. Παρόλο
που η πλειοψηφία των μεταλλάξεων που βρέθηκαν εντοπίζονται στα γνωστά «θερμά
σημεία» του γονιδίου παρατηρήθηκαν διαφορές στα όρια των μεταλλάξεων σε σχέση
με τα αναφερόμενα στην διεθνή βιβλιογραφία.
Συμπεράσματα
1. Παρατηρήθηκε μη τυχαία κατανομή μεγάλου αριθμού ελλείψεων στο κεντρομερικό
«θερμό σημείο» (εξόνια 45-55) καθώς επίσης και μεγάλου αριθμού διπλασιασμών στο
αμινοτελικό «θερμό σημείο» (εξόνια 2-8). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με την
διεθνή βιβλιογραφία, (Tuffery-Giraud S et al, 2009, Aartsma-Rus A et al, 2006).
Ανάμεσα στις 31 σημειακές μεταλλάξεις που εντοπίστηκαν, παρατηρήθηκε συσσώρευση
μεταλλάξεων στα εξόνια 21 και 66, με τρείς διαφορετικές μεταλλάξεις στο κάθε
ένα.
2. Κατά την διάρκεια της μελέτης αποκαλύφθηκαν 31 σημειακές μεταλλάξεις του
γονιδίου της δυστροφίνης σε ασθενείς με μυϊκή δυστρο¬φία Duchenne Becker.
Συγκεκριμένα, 37% των μεταλλάξεων ήταν μεταλλάξεις αλλαγής πλαισίου ανάγνωσης,
17% ήταν μεταλλάξεις σε σημεία ματίσματος και 46% μεταλλάξεις που προκαλούν
πρόωρο κωδικόνιο λήξεις. Τα αποτελέσματα της μελέτης συμφωνούν και με την
διεθνή βιβλιογραφία παρόλο που ο αριθμός των ασθενών δεν ήταν ικανός για να
διευκρινιστεί το ποσοστό των σημειακών μεταλλάξεων σε ασθενείς με Duchenne, και
Becker ξεχωριστά.
3. Απαιτείται η μελέτη των μεταλλάξεων στο γονίδιο της δυστροφίνης ακόμα και
στις περιπτώσεις ασθενών που εμφανίζουν απλά υποκλινικά συμπτώματα (όπως
αυξημένα CPK) καθώς και σε περιπτώσεις φορέων της νόσου.
4. Η δυσκολία μοριακής επιβεβαίωσης πολλών νευρομυικών παθήσεων οδηγεί στην
παραπομπή για έλεγχο του γονιδίου DMD περιστατικών όπου η δυστροφινοπάθεια
αποτελεί διαφορική διάγνωση. Ως εκ τούτου πολλοί ασθενείς παραπέμπονται χωρίς
να έχουν την τυπική κλινική εικόνα δυστροφινοπάθειας (αρκετές παραπομπές έχουν
γίνει με μοναδικό εύρημα αυξημένα CPK στο αίμα) γεγονός που ερμηνεύει το
μειωμένο ποσοστό διάγνωσης στην παρούσα μελέτη.
Λέξεις-κλειδιά:
Δυστροφίνη, ECMA, MLPA, Νέες Τεχνολογίες, DMD/BMD
Ευρετήριο:
Όχι
Αρ. σελίδων ευρετηρίου:
0
Εικονογραφημένη:
Ναι
Αρ. βιβλιογραφικών αναφορών:
190
Αριθμός σελίδων:
138