Περίληψη:
Στην παρούσα μελέτη αναπτύχθηκαν μέθοδοι ανίχνευσης, επιβεβαίωσης ή/και
ποσοτικοποίησης απαγορευμένων ουσιών κατά τον έλεγχο ντόπινγκ που εφαρμόζεται
σε δείγματα ούρων αθλητών ή αλόγων με εφαρμογή της τεχνικής LC/TOF-MS. Το πρώτο
μέρος της εργασίας εστιάζεται στην εφαρμογή της τεχνολογίας LC/TOF-MS στην
ανάπτυξη μεθόδου πολλαπλής ανίχνευσης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών και
το δεύτερο μέρος, στην ανάπτυξη μεθόδων ποσοτικοποίησης ουσιών ορίου σε ούρα
αλόγων.
Η ενοποίηση διαφορετικών πρωτοκόλλων σάρωσης για την πολλαπλή ανίχνευση
απαγορευμένων ουσιών αποτελεί σημαντική επιδίωξη για τα εργαστήρια ντόπινγκ.
Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε μέθοδος ανίχνευσης 266 αναλυτών από όλες τις
κατηγορίες χαμηλού Μ.Β. ουσιών που αναφέρονται στη Λίστα του WADA. Η
προτεινόμενη μεθοδολογία βασίστηκε στην εφαρμογή πορείας υγρό-υγρό εκχύλισης
και ανάλυση των δειγμάτων με σύστημα UHPLC /QTOF-MS, το οποίο ρυθμίστηκε σε
λειτουργία λήψης φασμάτων πλήρους σάρωσης. Η πορεία κατεργασίας που
χρησιμοποιήθηκε εφαρμοζόταν ήδη στο Εργαστήριο του ΟΑΚΑ για την ανίχνευση
αναβολικών παραγόντων και ελέχθηκε η αποδοτικότητά της στην ανίχνευση και άλλων
κατηγοριών ουσιών. Κατά τον έλεγχο αξιολόγησης της μεθόδου μελετήθηκε η
ειδικότητα, η επιδραση υποστρώματος, η ανάκτηση, η επαναληψιμότητα, η ικανότητα
ακριβούς μέτρησης μάζας και υπολογίστηκαν τα όρια ανίχνευσης. Τέθηκαν κριτήρια
ανίχνευσης μιας ουσίας με την προτεινόμενη μεθοδολογία, τα οποία βασίζονται στο
χρόνο ανάσχεσης και στην ακρίβεια μέτρησης του λόγου m/z. Η καταλληλότητα της
προτεινόμενης μεθόδου ελέγχθηκε περαιτέρω με εφαρμογή της στην ανάλυση
πραγματικών θετικών δειγμάτων. Η δυνατότητα λήψης φασμάτων ακριβούς μάζας
πλήρους σάρωσης που παρέχεται με την τεχνολογία TOF/MS επέτρεψε επιπλέον την
αναδρομική επανεξέταση δειγμάτων που έχουν αναλυθεί στο παρελθόν προκειμένου να
διαπιστωθεί η λήψη νέων ουσιών που εισάγονται μετέπειτα στη Λίστα του WADA,
όπως και έγινε με την περίπτωση ανίχνευσης της ουσίας 4-methyl-2-hexanamine.
Στο δεύτερο μέρος αναπτύχθηκαν μέθοδοι LC/MS για την ποσοτικοποίηση 4 ουσιών
ορίου σε ούρα αλόγων (υδροκορτιζόνη, θεοβρωμίνη, σαλικυλικό οξύ,
3-μεθοξυτυραμίνη). Κοινή προσέγγιση αποτέλεσε η εφαρμογή της απλούστερης
πορείας προκατεργασίας των δειγμάτων ούρων (απευθείας έγχυση αραιωμένων ούρων
στο σύστημα LC/MS). Αποδείχθηκε μέγιστης σημασίας η μελέτη της επίδρασης του
μητρικού υλικού και η επιλογή σε κάθε περίπτωση της κατάλληλης μεθοδολογίας που
οδήγησε στην εξαγωγή αξιόπιστων αποτελεσμάτων ποσοτικοποίησης. Επιπλέον, οι
μέθοδοι επέτρεψαν και την ταυτοποίηση των ουσιών στο ίδιο πρωτόκολλο και σε
κάποιες περιπτώσεις και στην ίδια ανάλυση με την ποσοτικοποίηση. Η αξιολόγηση
των μεθόδων διασφάλισε την αξιοπιστία τους για την εφαρμογή τους στον έλεγχο
ντόπινγκ και ακολούθησε η εφαρμογή τους στον προσδιορισμό των προαναφερθέντων
ουσιών σε πραγματικά δείγματα αλόγων.
Λέξεις-κλειδιά:
Eλεγχος ντόπινγκ, Yγροχρωματογραφία/φασματομετρία μαζών, Φασματομετρία μαζών χρόνου πτήσης, Ελεγχος σάρωσης αθλητών, Επιδραση μήτρας
