Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Κουππάρης Μιχαήλ Καθηγητής ΕΚΠΑ Επιβλέπων, Θωμαίδης Νικόλαος Επίκουρος Καθηγητής ΕΚΠΑ, Οικονόμου Αναστάσιος Επίκουρος Καθηγητής ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη και επικύρωση μιας μεθόδου σάρωσης
(screening), για την ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών με χρήση
υγροχρωματογραφίας-φασματομετρίας μαζών και αναλυτή χρόνου πτήσης σε σειρά με
τετράπολo (Liquid Chromatography-Quadrupole-Time of Flight, LC-QTOF). Για τον
ιοντισμό των ουσιών, έγινε χρήση ιοντισμού με ηλεκτροψεκασμό θετικής
πολικότητας [electrospray ionization, (+)ESI].
Σε πρώτη φάση, διερευνήθηκε ένα σύνολο ουσιών όσον αφορά το χρόνο
ανάσχεσής τους, το σχετικό χρόνο ανάσχεσής τους ως προς εσωτερικό πρότυπο και
τα χαρακτηριστικά ιόντα που εμφανίζουν στο χρωματογράφημα. Η μελέτη αυτή έγινε
με χρήση προτύπων διαλυμάτων και είχε ως στόχο την επιλογή των ιόντων που
εμφάνιζαν τις υψηλότερες σε ένταση κορυφές για κάθε ουσία. Παράλληλα, έγινε
εντοπισμός των ουσιών που συνεκλούονταν και διαχωρισμός των επιμερών σε όποιες
ενώσεις εμφανίζονταν.
Στη συνέχεια, εξετάστηκε μια σειρά παραμέτρων, όσον αφορά στη διαδικασία
προετοιμασίας των δειγμάτων. Οι παράμετροι που εξετάστηκαν ήταν η επιλογή
διαλύτη εκχύλισης, το pH της εκχύλισης, η σύσταση και ο όγκος του διαλύτη
ανασύστασης, καθώς και η προσθήκη άλατος κατά την διάρκεια της παρασκευαστικής
πορείας. Τα αναλυτικά αποτελέσματα της εκάστοτε παρασκευαστικής πορείας
αξιολογήθηκαν και τελικά επιλέχθηκε η πορεία εκείνη που έδινε τα βέλτιστα
αποτελέσματα ως προς τον αριθμό των ανιχνευόμενων ουσιών, τη διαχωριστικότητα,
την ευαισθησία και τη σταθερότητα των χρόνων ανάσχεσης.
Για τον προσδιορισμό των ουσιών boldenone, methyldienolone και
methyltrienolone που υφίστανται παρεμποδίσεις από το υπόστρωμα, κρίθηκε
απαραίτητο να πραγματοποιηθεί ένας συνδυασμός χρήσης φασματομετρίας μαζών (MS)
και δίδυμης φασματομετρίας μαζών (MS/MS).
Για την αξιολόγηση της καταλληλότητας της μεθόδου που τελικά αναπτύχθηκε
-και που βασίζεται στην εκχύλιση με οξεικό αιθυλεστέρα- , σχεδιάστηκε μια σειρά
πειραμάτων επικύρωσης (validation), βάσει των προδιαγραφών του τρέχοντος
Διεθνούς Προτύπου (International Standard for Laboratories, ISL). Συνολικά
προσδιορίσθηκαν 251 ουσίες (αναβολικά, γλυκοκορτικοστεροειδή, διεγερτικά,
ναρκωτικά, διουρητικά, β-αναστολείς, β2-αγωνιστές κ.α.) και μεταβολίτες αυτών.
Η μέθοδος αξιολογήθηκε ως προς το όριο ανίχνευσής των ουσιών, τα χρωματογραφικά
τους χαρακτηριστικά, την ύπαρξη επιμόλυνσης, την ύπαρξη παρεμποδίσεων από το
δείγμα, την ειδικότητά της για κάθε ουσία, την ικανότητα μέτρησης της ακριβούς
μάζας, την ανάκτηση από την εκχύλιση και την επίδραση μήτρας για κάθε ουσία.
Πέρα από τα πειράματα επικύρωσης, η αποτελεσματικότητα της μεθόδου
επιβεβαιώθηκε με τον προσδιορισμό μεταβολιτών σε μεταβολικά δείγματα ούρων
ανθρώπων. Συνολικά προσδιορίστηκαν 40 διαφορετικοί μεταβολίτες (μεταξύ των
οποίων μεταβολίτες συζευγμένοι ως θειικοί εστέρες), 18 πρόδρομες απαγορευμένες
ουσίες, μέρος των οποίων ανιχνεύονται για πρώτη φορά μετά από εκχύλιση σε
οξεικό αιθυλεστέρα.
H μέθοδος κρίνεται κατάλληλη για τον προσδιορισμό 227 απαγορευμένων ουσιών
και μεταβολιτών.
Λέξεις-κλειδιά:
Υγροχρωματογραφία, Φασματομετρία Μαζών, Αναλυτής Χρόνου Πτήσης, Οξεικός αιθυλεστέρας, Έλεγχος Ντόπινγκ
