Περίληψη:
Η φαινυλοκετονουρία (PKU) και η ανεπάρκεια της αφυδρογονάσης των μεσαίας
αλυσίδας ακυλοσυνενζύμων Α (MCADD) είναι δύο μεταβολικές διαταραχές με
αυτοσωμικό υπολειπόμενο χαρακτήρα, έλεγχος των οποίων περιλαμβάνεται στα
προγράμματα νεογνικού ελέγχου των περισσοτέρων Ευρωπαϊκών χωρών λόγω της
σχετικά υψηλής συχνότητας εμφάνισής τους (1:10.000-1:15.000). Η διάγνωση της
PKU πραγματοποιείται μέσω προσδιορισμού τόσο της συγκέντρωσης της
φαινυλαλανίνης (Phe) όσο και του λόγου φαινυλαλανίνης/τυροσίνη (Phe/Tyr) στο
αίμα ή τα ούρα. Από την άλλη πλευρά, οι ουσίες που αποτελούν τους κυριότερους
δείκτες για την MCADD είναι οι εξανοϋλο- (C6), η οκτανοϋλο- (C8), η δεκανοϋλο-
(C10) καρνιτίνη και δευτερευόντως ο λόγος C8 / C10, καθώς και οι λόγοι των
ακυλοκαρνιτινών με την ακετυλοκαρνιτίνη (C2) δηλαδή οι λόγοι C6 / C2, C8 / C2,
C10 / C2.
Στην εργασία αυτή παρουσιάζεται η ανάπτυξη μεθόδου υγρής χρωματογραφίας-
φασματομετρίας μαζών (HPLC-MS/MS) για τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό των
προαναφερόμενων ουσιών σε αποξηραμένες κηλίδες αίματος νεογνών. Η μέθοδος δεν
απαιτεί παραγωγοποίηση των δειγμάτων ούτε τη χρήση ισοτοπικά επισημασμένων
προτύπων και ο συνολικός χρόνος ανάλυσης είναι πέντε λεπτά ανά δείγμα. Ο
ποσοτικός προσδιορισμός των ουσιών πραγματοποιείται μέσω καμπύλης βαθμονόμησης
η οποία κατασκευάζεται με ανάλυση προτύπων δειγμάτων αίματος, αποξηραμένου σε
απορροφητικό χαρτί. Για την ανάπτυξη της μεθόδου προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες
συνθήκες ανίχνευσης των ουσιών με MS, οι βέλτιστοι διαλύτες εκχύλισης των
ουσιών από τις αποξηραμένες κηλίδες αίματος, και οι βέλτιστες συνθήκες για την
επίτευξη πλήρους διαχωρισμού των ουσιών μέσω HPLC. Λόγω του διαχωρισμού των
ουσιών πριν την αίχνευση τους με MS, η μέθοδος προσφέρει τη δυνατότητα
ποσοτικού προσδιορισμού που βασίζεται στο σήμα του προδρόμου ιόντος, αυξάνοντας
σημαντικά την ευαισθησία ανίχνευσης συγκριτικά με μεθόδους MS/MS στις οποίες η
ποσοστικοποίηση επιτυγχάνεται μέσω της χρήσης εσωτερικών προτύπων και πρέπει να
στηρίζεται στο σήμα του θυγατρικού ιόντος εφόσον θα πρέπει να αποφευχθούν
ψευδώς θετικά αποτελέσματα λόγω της παρουσίας ισοβαρών ουσιών ή ιόντων με το
ίδιο m/z ως προς τις προσδιοριζόμενες ουσίες.
Η μέθοδος χαρακτηρίζεται από υψηλή αναλυτική ευαισθησία, ακρίβεια και
επαναληψιμότητα. Τα όρια ανίχνευσης ήταν 1,3 μmol/L για την Phe, 4,7 μmol/L για
την Tyr, 0,40 μmol/L για τη C2 και 0,006, 0,008 και 0,008 για τις C6, C8, C10,
αντίστοιχα. Οι καμπύλες βαθμονόμησης για όλες τις ουσίες ήταν γραμμικές
(r2>0,99) από 24 έως 800 μmol/L για την Phe και Tyr, από 3 έως 100 μmol/L για
την C2 και από 0,1 έως 10 μmol/L για τις C6, C8 και C10. Ο έλεγχος της
ακρίβειας πραγματοποιήθηκε μέσω πειραμάτων προσθήκης γνωστών συγκεντρώσεων των
ουσιών σε δείγματα. Η ανάκτηση κυμαινόταν από 93% έως 105%, υποδεικνύοντας την
ακρίβεια της μεθόδου. Η ενδο- και διαναλυτική διάκυμανση ήταν μικρότερες από
10% και 15%, αντίστοιχα, για όλες τις ουσίες. Η μέθοδος έχει υψηλή ειδικότητα
και δεν παρατηρήθηκαν επιδράσεις από τη βιολογική μήτρα. Τέλος, η αξιολόγηση
της μεθόδου πραγματοποιήθηκε μέσω της ανάλυσης 450 δειγμάτων νεογνών
(αποξηραμένων κηλίδων αίματος) τόσο με την αναπτυχθείσα μέθοδο όσο και με
ημιποσοτική μέθοδο που βασίζεται στη χρήση εμπορικά διαθέσιμης συσκευασίας, η
οποία περιλαμβάνει ισοτοπικά επισημασμένες ενώσεις ως εσωτερικά πρότυπα. Τα
αποτελέσματα που ελήφθησαν για τις δύο μεθόδους ήταν σε συμφωνία τόσο ως προς
τα δείγματα, των οποίων οι τιμές βρίσκονταν εντός φυσιολογικών ορίων, όσο και
ως προς μικρό αριθμό δειγμάτων των οποίων οι τιμές υπερέβαιναν τα φυσιολογικά
όρια.
Λαμβάνοντας υπόψη την εξαιρετική αναλυτική απόδοση της μεθόδου σε συνδυασμό με
το σύντομο χρόνο ανάλυσης (5 λεπτά), ο οποίος επιτρέπει την ανάλυση
περισσοτέρων των 250 δειγμάτων ανά ημέρα, η μέθοδος που αναπτύχθηκε είναι
κατάλληλη για την εφαρμογή της στον νεογνικό έλεγχο ρουτίνας της PKU και της
MCADD.
Λέξεις-κλειδιά:
Φαινυλοκετονουρία, Ανεπάρκεια της αφυδρογονάσης των μεσαίας αλυσίδας ακυλοσυνενζύμων Α, Αποξηραμένες κηλίδες αίματος, HPLC-MS/MS
