Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Ιωάννης Λουκάς Αναπλ. Καθηγητής (Επιβλέπων), Ειρήνη Παντερή Αναπλ. Καθηγήτρια , Ιωάννης Ντότσικας Επίκ. Καθηγητής
Περίληψη:
Η ανεπάρκεια της αφυδρογονάσης του ακυλο-συνενζύμου Α λιπαρών οξέων μέσης
αλύσου (medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency, MCADD) είναι η πιο
συχνή διαταραχή της οξείδωσης των λιπαρών οξέων και αποτελεί στόχο των
προγραμμάτων νεογνικού ελέγχου σε πολλές χώρες. Η συχνότητα της MCADD έχει
υπολογιστεί 1:15.000 γεννήσεις στους πληθυσμούς με Ευρωπαϊκή καταγωγή. Η
ηλικία εμφάνισης των συμπτωμάτων ποικίλει συνήθως από την ηλικία των τριών
μηνών έως τριών ετών και περιλαμβάνουν εμετό, λήθαργο, υπογλυκαιμικά επεισόδια
που μπορούν να οδηγήσουν ακόμη και σε αιφνίδιο θάνατο. Οι ασθενείς με MCADD
βρίσκονται σε κίνδυνο σε περιόδους νηστείας ή μολύνσεων. Ωστόσο, η πρώιμη
διάγνωση της νόσου οδηγεί στην πρόληψη εμφάνισης σοβαρών μεταβολικών κρίσεων,
οι οποίες στο 26% των περιπτώσεων οδηγούν σε θάνατο. Η διάγνωση της MCADD
γίνεται μέσω των προγραμμάτων νεογνικού ελέγχου με τη χρήση κηλίδων αίματος
ξηραμένων επί χάρτου που λαμβάνονται από το νεογνό κατά τις πρώτες 48-72 h μετά
τη γέννηση. Οι πρωτεύοντες δείκτες που σχετίζονται με την MCADD είναι οι C6
(hexanoyl-carnitine, εξανοϋλοκαρνιτίνη), C8 (octanoyl-carnitine,
οκτανοϋλοκαρνιτίνη) και C10 (decanoyl-carnitine, δεκανοϋλοκαρνιτίνη) καθώς και
οι λόγοι C8/C10 και C8/C2. Όταν οι τιμές των δεικτών αυτών είναι πάνω από τα
οριοθετημένα cutoff values το δείγμα θεωρείται “θετικό”. Στην συνέχεια
λαμβάνεται επαναληπτικό δείγμα για επανεξέταση και ακολουθεί μοριακός έλεγχος
για τον έλεγχο μεταλλάξεων στο γονίδιο ACADM, που έχουν συσχετιστεί με την
MCADD, με πιο συχνή την 985A>G. Eαν δεν ανιχνευτεί κάποια από τις γνωστές
μεταλλάξεις γίνεται αλληλούχιση του γονιδίου.Στην παρούσα εργασία, αρχικά
κατασκευάστηκαν τα διαγράμματα στατιστικού ελέγχου (control charts) για τους
πρωτεύοντες δείκτες που σχετίζονται με την MCADD. Στη συνέχεια επαληθεύτηκαν
τα διαγνωστικά όρια ανίχνευσης (cut off values) για αυτούς ενδογενείς δείκτες
ως εξής: C6 (>0,47 μmol/L), C8(>0,42 μmol/L), C10(>0,42 μmol/L), C8/C10 (>1,60
μmol/L), C8/C2 (>0,06 μmol/L). Συνολικά, εξετάστηκαν 1000 δείγματα νεογνών για
το προφίλ των ακυλοκαρνιτινών. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε περιλαμβάνει την
απόσπαση κηλίδων αίματος ξηραμένων επί χάρτου και την μετέπειτα εκχύλιση των
μεταβολιτών σε μεθανολικό εκχύλισμα. Ταυτόχρονα, έγινε προσθήκη ισοτοπικά
επισημασμένων αναλυτών και εξάτμιση υπό ρεύμα αζώτου Ακολούθησε παραγωγοποίηση
του δείγματος με χρήση βουτανόλης σε HCL 3Μ, εξάτμιση και επανασύσταση σε
κινητή φάση με σύσταση ACN/H2O 80:20, 0,1% HCOOH) και ανάλυση LC-MS/MS με τη
χρήση του API 2000. Η τεχνική που επιλέχθηκε ήταν η παρακολούθηση
προεπιλεγμένου αριθμού ιόντων (MRM) και ο υπολογισμός και η εξαγωγή των τιμών
έγινε με τη χρήση του λογισμικού Chemoview. Από τα 1000 δείγματα που
αναλύθηκαν, στα 10 οι τιμές των ενδογενών δεικτών C8, C8/C10 και C8/C2
υπερέβαιναν τα cut offs και ζητήθηκε επαναληπτικό δείγμα. Οι τιμές των
προαναφερθέντων δεικτών εξακολούθησαν να είναι αυξημένες και στο επαναληπτικό
δείγμα και ακολούθησε μοριακός έλεγχος.Το ένζυμο MCAD κωδικοποιείται από το
γονίδιο ACADM (OMIM 607008) στο οποίο έχουν ανιχνευτεί περίπου 80 μεταλλάξεις
που προκαλούν τη διαταραχή MCAD. Η πιο συχνή μετάλλαξη που προκαλεί την MCADD
είναι η μετάλλαξη 985Α>G που οδηγεί στην αντικατάσταση της λυσίνης από
γλουταμικό οξύ στη θέση 304 της πρωτεΐνης. Με τη χρήση real-time PCR τα
δείγματα εξετάστηκαν για τη μετάλλαξη 985Α>G και εντοπίστηκαν δυο ομόζυγα
δείγματα γι’ αυτή τη μετάλλαξη και δυο ετερόζυγα. Ακολούθησε αλληλούχιση του
γονιδίου ACΑDM και εντοπίστηκε ότι το 1 από τα 2 ετερόζυγα για την 985Α>G
μετάλλαξη δείγματα, ήταν διπλά ετερόζυγο καθώς έφερε και τη μετάλλαξη
c.1007G>A. Επίσης, εντοπίστηκαν δυο δείγματα ετερόζυγα για τη μετάλλαξη
244-245insT εκ των οποίων το ένα ήταν διπλά ετερόζυγο καθώς έφερε και τη
μετάλλαξη c.734C>T. Η μετάλλαξη 244-245insT είχε εντοπιστεί με παρόμοια
διαδικασία από τον Andersen43 σε δείγματα νεογνών με αυξημένες τιμές για τους
ενδογενείς δείκτες που σχετίζονται με την MCADD. Aπο τα αποτελέσματα είναι
εμφανές ότι η μετάλλαξη 244-245ins T εμφανίζεται σε μεγάλο ποσοστό στον
ελληνικό πληθυσμό σε σχέση με άλλους πληθυσμούς. Επίσης, παρατηρήθηκε
συσχέτιση των τιμών των ενδογενών δεικτών που σχετίζονται με την MCADD με το
μοριακό προφίλ των ατόμων γεγονός που υποδεικνύει τη συσχέτιση βιοχημικού
φαινότυπου-γονότυπου.
