Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Γαλανοπούλου Ντία Αναπλ. Καθηγήτρια ΕΚΠΑ (επιβλέπουσα), Παπασιδέρη Ι. Αναπλ. Καθηγήτρια ΕΚΠΑ, Μπολέτη Χ. Ερευνήτρια Β΄ Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ
Περίληψη:
Τα φωσφοϊνοσιτίδια είναι μεμβρανικά λιπίδια που ρυθμίζουν σημαντικές
λειτουργίες των ευκαρυωτικών κυττάρων, λειτουργίες που στηρίζονται σε πορείες
μεταγωγής σήματος ή πορείες κυκλοφορίας μεμβρανών. Η ρύθμιση γίνεται κατά κύριο
λόγο μέσω αναγνώρισης των φωσφοϊνοσιτιδίων από διατηρημένους πρωτεϊνικούς
υποτομείς με αποτέλεσμα είτε ενεργοποίηση της πρωτεΐνης που περιέχει τον
υποτομέα είτε εξειδικευμένη προσέγγιση της πρωτεΐνης σε συγκεκριμένη κυτταρική
μεμβράνη. Ο μονοκύτταρος ευκαρυωτικός οργανισμός T. thermophila διαθέτει
τέσσερα μέλη της ομάδας των φωσφοϊνοσιτιδίων (που μάλιστα συμμετέχουν και στη
ρύθμιση συγκεκριμένων λειτουργιών), σηματοδοτικές PLC ειδικές για τα
φωσφοϊνοσιτίδια και, βάσει βιοπληροφορικών δεδομένων, όλα τα ένζυμα βιοσύνθεσης
των φωσφοϊνοσιτιδίων (κινάσες). Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να μελετηθεί
ο υποκυτταρικός εντοπισμός των φωσφοϊνοσιτιδίων στα κύτταρα της T. thermophila
με χρήση πρωτεϊνικών υποτομέων που αναγνωρίζουν φωσφοϊνοσιτίδια και μικροσκοπία
φθορισμού. Αρχικά, με χρήση προγραμμάτων βιοπληροφορικής, εντοπίστηκαν όλες οι
πρωτεΐνες που περιέχουν υποτομείς αναγνώρισης φωσφοϊνοσιτιδίων στην T.
thermophila (PH, FYVE, PX, ENTH, GRAM, C2). Η διατήρηση αμινοξικών καταλοίπων
κατά την ευθυγράμμιση οδήγησε στην επιλογή δυο υποτομέων PH, αυτών των
πρωτεϊνικών κινασών TtPDK1 (TTHERM_00188930) και PHK5 (TTHERM_00666380) και του
υποτομέα FYVE της λιπιδικής κινάσης TtPIPK3 (TTHERM_01005090) που είναι
υποψήφιοι για αλληλεπίδραση με την PtdInsP3 και PtdIns3P, αντίστοιχα. Για την
παραλαβή των επιλεγμένων υποτομέων, απομονώθηκε ολικό RNA από κύτταρα T.
thermophila, μετατράπηκε σε cDNA και ακολούθησε ενίσχυση των υποτομέων με PCR
με χρήση των κατάλληλων εκκινητών που περιλάμβαναν θέσεις κοπής για τα
περιοριστικά ένζυμα XhoI και ApaI. To cDNA των επιλεγμένων υποτομέων
ενσωματώθηκε αρχικά στον ενδιάμεσο φορέα pTZ57R/T, ώστε να γίνει αλληλούχισή
του, και ακολούθησε ενσωμάτωση του υποτομέα PHTtPDK1 στον ειδικό για την
Tetrahymena καδμιοεπαγώμενο φορέα έκφρασης pVGF, ο οποίος φέρει το γονίδιο της
GFP ανοδικά του σημείου ενσωμάτωσης και θέσεις κοπής για τα XhoI και ApaI. Το
στάδιο της εισαγωγής υποτομέα αναγνώρισης φωσφοϊνοσιτιδίων σε κύτταρα T.
thermophila έγινε με χρήση του υποτομέα PHPLCδ1 ανθρώπινων κυττάρων
(αναγνωρίζει εξειδικευμένα την PtdIns(4,5)P2) ενσωματωμένου στον pVGF. Η
εισαγωγή έγινε με ηλεκτροδιάτρηση σε κύτταρα που βρίσκονταν σε σύζευξη και,
μετά την έκφραση, ο εντοπισμός του υποτομέα μελετήθηκε με μικροσκοπία
φθορισμού. Εντοπίστηκε φθορισμός στην περιοχή του κυτοστόματος των κυττάρων,
εύρημα που υποδεικνύει τον εμπλουτισμό της περιοχής αυτής σε PtdIns(4,5)P2 και
συμφωνεί με προηγούμενα βιοχημικά δεδομένα. Ένα επιπλέον εύρημα της διατριβής
είναι η ύπαρξη κινασών τύπου AKT (PHK5) και PDK1 στην T. thermophila που, σε
συνδυασμό με βιοπληροφορικά δεδομένα που δείχνουν την ύπαρξη τριών 3-κινασών
τύπου I και τριών πρωτεϊνών τύπου PTEN, δηλώνει την πιθανή ύπαρξη σηματοδότησης
μέσω της PtdInsP3 στην Tetrahymena.
Λέξεις-κλειδιά:
Φωσφοϊνοσιτίδια, Πρωτεϊνικοί υποτομείς αναγνώρισης φωσφοϊνοσιτιδίων, PH, FYVE, Tetrahymena
