Μονάδα:
ΠΜΣ με ειδίκευση ΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑΒιβλιοθήκη Σχολής Θετικών Επιστημών
Ημερομηνία κατάθεσης:
2015-02-02
Συγγραφέας:
Ιωαννίδης Χαράλαμπος
Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Aντώνιος Κολοκούρης Αναπλ. Καθηγητής (Επιβλέπων), Ζωή Κούρνια Ερευνήτρια Δ΄, Εμμανουήλ Μικρός Καθηγητής
Πρωτότυπος Τίτλος:
Πειραματική και υπολογιστική μελέτη της αλληλεπίδρασης αμινοαδαμαντανικών προσδετών με τον διαμεμβρανικό πόρο του ιοντικού διαύλου της πρωτεΐνης του ιού της influenza A/M2
Γλώσσες εργασίας:
Ελληνικά
Μεταφρασμένος τίτλος:
Εxperimental and computational study of aminoadamantane derivatives interactions with the transmembrane domain of influenza A/M2 virus ion channel
Περίληψη:
Η πρωτεΐνη του ιού της γρίπης τύπου Α σχηματίζει ομοτετραμερή και η
διαμεμβρανική της περιοχή (ΤΜ) σχηματίζει έναν ιοντικό δίαυλο κατιόντων οξωνίου
που ενεργοποιείται από το όξινο pH στο ενδοσωματιδιακό κυστίδιο. Η ενεργοποίηση
του διαύλου προκαλεί απευλευθέρωση του ιικού RNA οδηγώντας στον πολλαπλασιασμό
του και προκαλώντας παθογένεια.
Έχει δειχθεί ότι αμινοαδαμαντανικά παράγωγα (Aamt), όπως η αμανταδίνη (Am) και
η ριμανταδίνη (Rim), μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αναστολείς του διαύλου της
Μ2 πρωτεΐνης του ιού της γρίπης τύπου Α/Μ2ΤΜ, όμως η χρήση τους έχει διακοπεί
εξαιτίας της ανάπτυξης ανθεκτικότητας στους ανθρώπους. Η κατανόηση του
μηχανισμού δράσης των αμινοαδαμαντανικών παραγώγων μπορεί να οδηγήσει στην
ανάπτυξη νέων ισχυρών αναστολέων που ξεπερνούν την ανθεκτικότητα της Α/Μ2ΤΜ.
Δυο διαφορετικές αλληλουχίες της Μ2ΤΜ, η αλληλουχία άγριου τύπου (WT) ή
αλληλουχία Udorn και η αλληλουχία Weybridge (V28I, L38F) συντέθηκαν με τη
μέθοδο πεπτιδικής σύνθεσης στερεάς φάσης και στη συνέχεια ταυτοποιήθηκαν.
Παρασκευάσθηκαν δείγματα που περιέχουν τα τετραμερή της Μ2ΤΜ σε pH 8 και
λιπιδικό περιβάλλον από διπαλμιτοϋλοφωσφατιδυλοχολίνη (DPC) και μετρήθηκαν οι
σταθερές σύνδεσης της Μ2ΤΜ με αμανταδίνη, ριμανταδίνη και αμινοαδαμαντανικά
παράγωγά τους με Θερμιδομετρία Ισοθερμικής Τιτλοδότησης (ITC) και για τις δύο
αλληλουχίες. Oι μετρήσεις επαληθεύουν τις γνωστές από τη βιβλιογραφία τιμές των
σταθερών σύνδεσης της αμανταδίνης και ριμανταδίνης με την πρωτεΐνη Α/Μ2.
Πραγματοποιήθηκαν ακόμη προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής (MD) για τη δομή του
συμπλόκου Μ2ΤΜ-Am σε αλκαλικό pH για την αλληλουχία Udorn (πειραματική δομή από
τράπεζα δεδομένων πρωτεϊνών: 2KQT.pdb) και Weybridge (δεν υπάρχει διαθέσιμη
πειραματική δομή). Oι δομές που ελήφθησαν μετά το πέρας της ΜD χρησιμοποιήθηκαν
σε υπολογισμούς μοριακής προσάραξης. Οι πειραματικές σταθερές σύνδεσης που
μετρήθηκαν έναντι των τετραμερών Α/Μ2ΤΜ σε pH 8 με ITC χρησιμοποιήθηκαν για την
αξιολόγηση και τη βελτίωση των αποτελεσμάτων των υπολογισμών. Οι υπολογισμοί
μοριακής προσάραξης με τη συνάρτηση βαθμολογίας ChemScore για την αλληλουχία
Udorn οδήγησαν σε συσχέτιση των ενεργειακών τιμών με τις πειραματικές σταθερές
σύνδεσης ίση με R2 = 0.50. Ωστόσο όλες οι άλλες συναρτήσεις βαθμολογίας
απέτυχαν να δώσουν στατιστικά σημαντική συσχέτιση και δεδομένης της εμπειρικής
κατασκευής των συναρτήσεων αυτών δοκιμάστηκαν πιο εύρωστες υπολογιστικές
μέθοδοι όπως υπολογισμοί διαταραχών ελεύθερης ενέργειας, που η θεμελίωσή τους
βασίζεται σε αρχές στατιστικής μηχανικής.
Έτσι, χρησιμοποιήθηκαν υπολογισμοί διαταραχών ελεύθερης ενέργειας σε συνδυασμό
με προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής (FEP/MD) του συμπλόκου Μ2ΤΜ-Αamt σε
λιπιδικό περιβάλλον 1,2-διπαλμιτοϋλο-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνης (DPPC) για να
δημιουργηθεί ένα πρωτόκολλο ικανό να προβλέπει τη σχετική ελεύθερη ενέργεια
σύνδεσης των αμινοαδαμαντανικών αναλόγων-προσδετών έναντι των τετραμερών
Α/Μ2ΤΜ. Η μέθοδος αυτή δίδει τη σχετική σταθερά πρόσδεσης στην πρωτεΐνη μεταξύ
δύο κοντινών χημικών αναλόγων με ακρίβεια 1 kcal/mol. Η μέθοδος FEP/MD
επιλέχθηκε γιατί από τη βιβλιογραφία είναι γνωστό πως είναι απαραίτητο να
αφεθούν ελεύθεροι όλοι οι βαθμοί ελευθερίας του συστήματος δηλαδή να υπάρχει
πλήρης ευκινησία της πρωτεΐνης και της επιδιαλυτωμένης λιπιδικής μεμβράνης DPPC
για τη σωστή πρόβλεψη σχετικών σταθερών σύνδεσης των αμινοαδαμαντανικών
αναστολέων και πιθανώς για τη βελτιστοποίηση νέων αμινοαδαμαντανικών προσδετών.
Με τη μέθοδο αυτή πραγματοποιήθηκαν εννέα αλχημικοί μετασχηματισμοί μεταξύ
αμινοαδαμαντανικών προσδετών, των οποίων οι σταθερές πρόσδεσης μετρήθηκαν με
ITC όπως αναφέρθηκε. Η συσχέτιση των εννέα αλχημικών μετασχηματισμών που
πραγματοποιήθηκαν στην αλληλουχία Udorn μεταξύ των πειραματικών δεδομένων και
υπολογιστικών προβλέψεων ήταν R2 = 0.85 ενώ η συσχέτιση μεταξύ των επτά
αλχημικών μετασχηματισμών που πραγματοποιήθηκαν στην αλληλουχία της Weybridge
ήταν R2 = 0.53. Τα αποτελέσματα δείχνουν ιδιαίτερα ικανοποιητικά αν ληφθεί
υπόψη το μεγάλο εύρος της περιοχής σύνδεσης που είναι πλήρως ενυδατωμένη,
συγκριτικά με μελέτες άλλων πρωτεϊνών όπου η περιοχή πρόσδεσης της πρωτεΐνης
είναι πιο εντοπισμένη και καλύτερα ορισμένη.
Τέλος, κατά το σχεδιασμό φαρμάκων για μεμβρανικές πρωτεΐνες πρέπει να
λαμβάνεται υπόψη το ενεργειακό κόστος αποδιαλύτωσης. Τα αποτελέσματα δείχνουν
ότι μειώνοντας το κόστος αποδιαλύτωσης διευκολύνεται η είσοδος των προσδετών
στην κοιλότητα πρόσδεσης μέσα στη μεμβρανική πρωτεΐνη, οπότε μπορεί να
εξασφαλιστεί καλύτερη συγγένεια σύνδεσης. Για παράδειγμα, η προσθήκη ενός CHCH3
στο αδαμαντάνιο από την αμανταδίνη στη ριμανταδίνη μπορεί να ελαττώσει το
κόστος αποδιαλύτωσης και να οδηγήσει σε καλύτερη συγγένεια σύνδεσης, όπως
φαίνεται από τις πειραματικές σταθερές σύνδεσης τους και όπως επιβεβαιώθηκε από
υπολογισμούς διαταραχών ελεύθερης ενέργειας. Από την άλλη, η αύξηση της
λιποφιλίας μπορεί να ελαττώσει τις ενθαλπικές δεσμικές αλληλεπιδράσεις εντός
του πόρου οδηγώντας στη μικρότερη συγγένεια των 2-αλκυλο-2-αδαμανταναμινών
συγκριτικά με τη 2-αδαμανταναμίνη. Για την επίτευξη καλής σύνδεσης χρειάζεται
ένας βέλτιστος συγκερασμός των δύο φαινομένων.
Λέξεις-κλειδιά:
Υπολογισμοί ελεύθερης ενέργειας, Διαταραχή, Ιός, Υπολογισμοί αγκυροβόλησης, Ισοθερμική θερμιδομετρία τιτλοδότησης
Αρ. σελίδων ευρετηρίου:
xiii-xx
Αρ. βιβλιογραφικών αναφορών:
144
